氧化低密度脂蛋白通過CD36介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬*

姚樹桐，李嚴(yán)嚴(yán)，劉慶華，岳　峰，田　華，桑　慧，楊娜娜，秦樹存△(泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，泰安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東泰安7000)

?

氧化低密度脂蛋白通過CD36介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬*

姚樹桐1，2△▲，李嚴(yán)嚴(yán)1▲，劉慶華3，岳峰4，田華1，?；?，楊娜娜1，秦樹存1△
(泰山醫(yī)學(xué)院1動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，4泰安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東泰安271000)

［摘要］目的:研究氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，并探討可能的分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，給予抗CD36單克隆抗體(2 mg/L)、二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI;5 μmol/L)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA; 3 mmol/L)或雷帕霉素(1 μmol/L)預(yù)處理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)12 h。采用MTT法檢測細(xì)胞活力，采用相應(yīng)試劑盒測定培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性以及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，以評價(jià)細(xì)胞膜完整性和氧化應(yīng)激反應(yīng)。采用免疫印跡技術(shù)檢測自噬標(biāo)志分子beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II)表達(dá)變化。結(jié)果: ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬反應(yīng)，表現(xiàn)為beclin-1和LC3-II上調(diào);與自噬抑制劑3-MA相似，抗CD36單抗可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的LC3-II和beclin-1表達(dá)?？笴D36單抗明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，包括抑制NADPH氧化酶活性和ROS、MDA水平以及升高SOD活性，其作用與NADPH氧化酶抑制劑DPI相似。另外，DPI顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的beclin-1和LC3-II表達(dá)，且ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低和LDH漏出可被3-MA促進(jìn)并可被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素拮抗。結(jié)論: ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，其機(jī)制可能與CD36介導(dǎo)ox-LDL攝取進(jìn)而觸發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)，且一定程度的自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷。

［關(guān)鍵詞］自噬;氧化低密度脂蛋白; CD36;氧化應(yīng)激;巨噬細(xì)胞

［修回日期］2015-03-03

▲并列第1作者

Oxidized low-density lipoprotein induces autophagy in macrophages via CD36-mediated oxidative stress

YAO Shu-tong1，2，LI Yan-yan1，LIU Qing-hua3，YUE Feng4，TIAN Hua1，SANG Hui2，YANG Na-na1，QIN Shu-cun1
(1Institute of Atherosclerosis，Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong，2College of Basic Medical Sciences，3Department of Clinical Laboratory，Affiliated Hospital，Taishan Medical University，4Department of Endocrinology，The Central Hospital of Taian，Taian 271000，China.E-mail: yst228@126.com; shucunqin@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) on autophagy in macrophages and the underlying molecular mechanisms.METHODS: RAW264.7 macrophages were pretreated with 2 mg/L anti-CD36 monoclonal antibody (anti-CD36 mAb)，5 μmol/L diphenyleneiodonium (DPI)，3 mmol/L 3-methyladenine (3-MA) or 1 μmol/L rapamycin for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) for 12 h.The viability of the cells was measured by MTT assay.The activities of lactic dehydrogenase (LDH) in the medium and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase，superoxide dismutase (SOD) in the cells as well as the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) were determined to characterize the membrane integrity and the oxidative stress，respectively.The protein levels of beclin-1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3-II (LC3-II)，2 important molecular markers of autophagy，were examined by Western blotting.RESULTS: ox-LDL induced autophagy inRAW264.7 macrophages as assessed by upregulation of beclin-1 and LC3-II.Similar to 3-MA，an autophagy inhibitor，anti-CD36 mAb significantly inhibited the ox-LDL-induced upregulation of beclin-1 and LC3-II.Anti-CD36 mAb suppressed the ox-LDL-induced oxidative stress as revealed by decreased NADPH oxidase activation，ROS and MDA generation as well as increased SOD activity.Similar results were observed in the cells pretreated with DPI，a NADPH oxidase inhibitor.Moreover，DPI significantly inhibited the ox-LDL-induced upregulation of beclin-1 and LC3-II.Inaddition，the decrease in the cell viability and increase in LDH release induced by ox-LDL were promoted by 3-MA and blocked by rapamycin (an autophagy inducer).CONCLUSION: ox-LDL induces autophagy in RAW264.7 macrophages，which may be involved in CD36-mediated ox-LDL uptake and subsequent activation of oxidative stress，and moderate activation of autophagy may protect macrophages from ox-LDL-induced injury.

［KEY WORDS］Autophagy; Oxidized low-density lipoprotein; CD36; Oxidative stress; Macrophage

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是一個(gè)復(fù)雜的多細(xì)胞參與的慢性炎癥性病理過程，其中修飾后的脂蛋白尤其是氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)所誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞形成和死亡是AS發(fā)展的核心環(huán)節(jié)和造成斑塊不穩(wěn)定的決定性因素，進(jìn)而導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生，因此巨噬細(xì)胞已成為減緩AS進(jìn)展尤其是降低心腦血管病事件發(fā)生率的重要治療靶點(diǎn)［1］。自噬是細(xì)胞將受損、變性的蛋白質(zhì)以及損傷細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為特征的細(xì)胞自我消化過程，是細(xì)胞在應(yīng)激情況下用來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和存活的一種重要防御機(jī)制［2］。近年來研究表明，AS斑塊中存在巨噬細(xì)胞自噬［3］，且自噬的激活可減輕AS病變，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性［4］，但其機(jī)制尚未完全闡明。CD36是介導(dǎo)ox-LDL大量攝取進(jìn)而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成的主要清道夫受體，本課題組既往研究證實(shí)，CD36可介導(dǎo)ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［5］，而槲皮素可通過下調(diào)CD36表達(dá)減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和氧化應(yīng)激反應(yīng)［6］，但是ox-LDL是否通過CD36觸發(fā)巨噬細(xì)胞自噬尚不清楚。本工作以ox-LDL與鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞共同孵育，研究細(xì)胞內(nèi)自噬關(guān)鍵分子beclin-1和標(biāo)志分子微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II)表達(dá)變化及CD36和氧化應(yīng)激在其中的作用，以探討ox-LDL對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用及機(jī)制。

材料和方法

1材料與試劑

ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司; DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品;2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHF-DA)和抗CD36單克隆抗體(anti-CD36 mAb)分別購自Molecular Probes和Abcam; RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒為Solarbio產(chǎn)品;兔抗beclin-1和LC3多克隆抗體購自Santa Cruz;雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)和兔抗β-actin抗體購自Sigma;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為北京中杉金橋公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4，5-dimeth-ylthiazol-2-y-l ) -2，5- diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］購自Genview;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和PVDF膜分別為Pierce和Millipore產(chǎn)品;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶測定試劑盒從上海杰美科技公司購買;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購于南京建成生物技術(shù)公司;其余試劑均為分析純。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理前換無血清DMEM培養(yǎng)基同步化12 h，然后隨機(jī)分為如下6組: (1)正常對照(control)組:培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng); (2) ox-LDL 組:培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL; (3)抗CD36單抗阻斷(anti-CD36 mAb+ ox-LDL)組:培養(yǎng)液中先加入2 mg/L anti-CD36 mAb預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (4) NADPH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理(DPI+ ox-LDL)組:培養(yǎng)液中先加入5 μmol/L DPI預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (5)自噬抑制劑3-MA預(yù)處理(3-MA+ ox-LDL)組:培養(yǎng)液中先加入3 mmol/L 3-MA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL; (6)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理(rapamycin+ ox-LDL)組:培養(yǎng)液中先加入1 μmol/L rapamycin預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。各組培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞。

2.2細(xì)胞活力和LDH測定將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞經(jīng)處理后，按既往報(bào)道的MTT分析方法［7］檢測細(xì)胞活力。以正常對照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其吸光度(A)值占對照組A值的百分比表示。

為進(jìn)一步檢測細(xì)胞損傷程度，按照LDH活性檢測試劑盒說明書測定培養(yǎng)基中LDH水平。

2.3活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的測定細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，處理后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCHF-DA，細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。收集洗滌細(xì)胞，并用PBS重懸，在流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)上檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

2.4細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量的測定細(xì)胞經(jīng)處理后，收集細(xì)胞，并重懸于0.5 mL裂解緩沖液中，用電動(dòng)細(xì)胞破碎機(jī)裂解，1 500 r/min離心10 min，收集上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測SOD活性和MDA含量，分別以1×103U/g蛋白和μmol/g蛋白表示。

2.5 NADPH氧化酶活性測定應(yīng)用光澤精增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測定細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性，具體方法依據(jù)試劑盒說明書操作。

2.6 Western blotting分析細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液在冰浴中裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。熱變性后，等量的各組總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(8%～10%分離膠)，然后電轉(zhuǎn)印移到PVDF膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h后，I抗孵育4℃過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)II抗室溫下孵育2 h。蛋白條帶通過ECL反應(yīng)顯示，應(yīng)用Chemi Q4800 mini型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行圖像采集。采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)值，以靶蛋白IA值與β-actin IA值的比值反映靶蛋白相對表達(dá)水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1抗CD36單抗抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬

Beclin-1是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵分子;自噬發(fā)生后，LC3-I經(jīng)泛素樣加工修飾形成LC3-II，進(jìn)而整合到自噬體膜中，在自噬體形成中起重要作用，因此beclin-1和LC3-II可作為自噬的標(biāo)志分子。以ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞12 h，LC3-II和beclin-1水平較對照組顯著增加(P＜0.01)，說明ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬;與自噬抑制劑3-MA相似，抗CD36單抗阻滯清道夫受體CD36后，可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的LC3-II和beclin-1表達(dá)(P＜0.05)，表明抗CD36抗體可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬，見圖1。

Figure 1.Anti-CD36 mAb inhibited ox-LDL-induced autophagy in RAW264.7 macrophages.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs ox-LDL group.圖1抗CD36單抗抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬

2抗CD36單抗抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)

如圖2所示，ox-LDL組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平較對照組均明顯升高，而SOD活性顯著降低(P＜0.01) ;而與氧化應(yīng)激抑制劑DPI相似，抗CD36單抗可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為ROS 和MDA含量降低(P＜0.05)，SOD活性增加(P＜0.05)。

3抗CD36單抗抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化

NADPH氧化酶是血管系統(tǒng)催化ROS生成導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要酶。與NADPH氧化酶抑制劑DPI相似，抗CD36單抗可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活性上調(diào)，其活性較ox-LDL組降低21.7% (P＜0.05)。以上結(jié)果表明，CD36介導(dǎo)ox-LDL所誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬反應(yīng)，見圖3。

Figure 2.Inhibitory effects of anti-CD36 mAb on ox-LDL-induced oxidative stress in RAW264.7 macrophages.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL group.圖2抗CD36單抗抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)

4 DPI抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬

為進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激在ox-LDL所誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)中的作用，我們研究了DPI對ox-LDL所致自噬反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，與ox-LDL組比較，DPI預(yù)處理組LC3-II和beclin-1蛋白水平分別降低了37.2%和40.0% (P＜0.05)，見圖4。

5 ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的作用可被3-MA促進(jìn)而被雷帕霉素拮抗

為了證明自噬在ox-LDL所致細(xì)胞損傷中的作用，研究了自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對ox-LDL所致細(xì)胞毒性的影響。如圖5所示，3-MA促進(jìn)了ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低和LDH漏出進(jìn)一步加重(P＜0.05) ;而雷帕霉素則可拮抗ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞活力增加和LDH漏出減少(P＜0.05)，表明自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

Figure 3.Anti-CD36 mAb inhibited ox-LDL-induced NADPH oxidase activation in RAW264.7 macrophages.Mean ±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL group.圖3抗CD36單抗抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化

Figure 4.DPI inhibited ox-LDL-induced autophagy in RAW264.7 macrophages.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL group.圖4 DPI抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬

討論

自噬是一種細(xì)胞將受損蛋白和細(xì)胞器以溶酶體依賴性降解方式再利用的過程，該過程以包繞胞漿成分的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，即自噬體為主要特征，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、適應(yīng)各種環(huán)境變化的重要機(jī)制。在饑餓、氧化應(yīng)激、缺血等應(yīng)激情況下，通過III型磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/beclin-1途徑的激活啟動(dòng)自噬，而該啟動(dòng)過程受哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路的負(fù)性調(diào)控。大約30多個(gè)自噬相關(guān)基因(autophagy-associated gene，ATG)參與了自噬的啟動(dòng)及進(jìn)展，其中ATG8，即LC3與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine，PE)結(jié)合轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ并與ATG5-ATG12-ATG16L整合于自噬體膜中，在自噬體的形成中起關(guān)鍵作用;進(jìn)而自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，在溶酶體水解酶的作用下將需要降解的物質(zhì)分解為各種營養(yǎng)物質(zhì)供機(jī)體再利用［2］。近年來研究表明，自噬參與AS時(shí)細(xì)胞死亡和存活的調(diào)控。在AS斑塊中存在血管細(xì)胞自噬樣特性:髓鞘樣結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)中泛素化包涵體聚集以及空泡形成增多［8］。來自血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的研究表明，ox-LDL及其主要氧化成分7-酮膽甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)均可誘導(dǎo)自噬［9-10］，且在AS斑塊中存在巨噬細(xì)胞自噬現(xiàn)象［3-4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL處理12 h后，beclin-1和LC3-II水平均顯著上調(diào)，表明ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬反應(yīng)。

CD36是巨噬細(xì)胞表面主要識別、攝取ox-LDL 的B類清道夫受體，其結(jié)合和攝取的ox-LDL占巨噬細(xì)胞結(jié)合和攝取修飾脂質(zhì)的50%以上，且不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)，造成大量脂質(zhì)蓄積而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成［11］，然而抑制CD36表達(dá)則可減緩AS進(jìn)展［12］。本課題組既往采用抗CD36單抗和基因沉默技術(shù)阻滯CD36功能，可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，并減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［5，13］，表明CD36在ox-LDL所觸發(fā)的巨噬細(xì)胞一系列生物學(xué)效應(yīng)中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用單克隆抗體阻斷CD36所介導(dǎo)的ox-LDL攝入可顯著減輕自噬反應(yīng)，表現(xiàn)為beclin-1和LC3-II上調(diào)均受到明顯抑制。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AS發(fā)病的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制［14］。來自血管平滑肌細(xì)胞的研究表明，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸和夾竹桃麻素可減輕7-KC對LC3-II的上調(diào)作用［10］，提示氧化應(yīng)激可能介導(dǎo)自噬的發(fā)生。ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激主要來自NADPH氧化酶衍生的ROS的生成過度和抗氧化酶活性的降低［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL處理后，NADPH氧化酶活性增加，SOD活性下降，ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成顯著增加。然而，與NADPH氧化酶抑制劑DPI相似，抗CD36單抗可拮抗上述變化，提示CD36介導(dǎo)的ox-LDL攝取可觸發(fā)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。為了進(jìn)一步證明CD36介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在巨噬細(xì)胞自噬激活中的作用，本實(shí)驗(yàn)又探討了DPI對ox-LDL所致自噬反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，DPI可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的beclin-1 和LC3-II上調(diào)。以上結(jié)果表明，CD36介導(dǎo)的ox-LDL攝取可觸發(fā)氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生。

Figure 5.The cytotoxicity of ox-LDL on RAW264.7 macrophages was promoted by 3-MA and blocked by rapamycin.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs ox-LDL group.圖5 ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的作用可被3-MA促進(jìn)而被雷帕霉素拮抗

近年來研究提示，自噬作為一種自適應(yīng)及保護(hù)性反應(yīng)，可延緩或減輕AS進(jìn)展。自噬反應(yīng)的增強(qiáng)可減輕血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞死亡，而自噬缺陷(ATG5－/－、ATG5 siRNA)或自噬抑制劑3-MA可加重ox-LDL、7-KC和游離膽固醇等因素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞損傷［9-10］。在巨噬源性泡沫細(xì)胞中，脂滴通過自噬途徑被運(yùn)輸至溶酶體，在溶酶體酸性酯酶的作用下，膽固醇酯被水解，產(chǎn)生游離膽固醇，然后通過ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1 (ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)途徑流出［16］。小鼠和兔AS模型證實(shí)，ATG5缺陷可增加AS斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，促進(jìn)斑塊壞死，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素則降低AS病變中巨噬細(xì)胞和膽固醇的含量，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性［4，10，17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-MA促進(jìn)了ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低和LDH漏出進(jìn)一步加重;而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素則可拮抗ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞活力增加和LDH漏出減少，表明自噬可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷。但是也有研究發(fā)現(xiàn)3-MA通過抑制III型PI3K活性抑制自噬而減輕香煙提取物所引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡［18］，mTOR激活劑3BDO可通過抑制自噬減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定apoE－/－小鼠AS病變［19］，提示自噬可加重香煙提取物和ox-LDL所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡;另外通過自噬途徑清除瀕死的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)炎癥激活和炎癥因子的釋放［20］。因此，自噬的激活是有益的還是有害的可能取決于疾病不同階段細(xì)胞內(nèi)底物負(fù)荷及細(xì)胞自噬降解的能力，其在AS發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

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通訊作者△姚樹桐Tel: 0538-6225010; E-mail: yst228@ 126.com;秦樹存Tel: 0538-6237252; E-mail: shucunqin@ hotmail.com

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202949; No.81370381)

［收稿日期］2014-11-25

［文章編號］1000-4718(2015)06-1002-06

［中圖分類號］R363.2; R332

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.007