維拉帕米通過(guò)阻斷鈣離子內(nèi)流抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化研究

李同妙，徐金升，馮 雨，張勝雷，張俊霞，崔立文，張慧然

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·論著·

維拉帕米通過(guò)阻斷鈣離子內(nèi)流抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化研究

李同妙，徐金升，馮 雨，張勝雷，張俊霞，崔立文，張慧然

目的 探討維拉帕米抑制高磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)鈣化的作用及可能機(jī)制。方法 2014年12月—2015年6月選取5～8周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠6只，體外分離培養(yǎng)大鼠VSMCs，采用免疫組化法鑒定。將對(duì)數(shù)期VSMCs隨機(jī)分為正常對(duì)照組〔含10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基〕、高磷組(高磷培養(yǎng)基，含10 mml/L β-甘油磷酸)、維拉帕米干預(yù)組(在高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入維拉帕米至濃度為20 mmol/L)。細(xì)胞接受2、4、6 d干預(yù)后，檢測(cè)VSMCs內(nèi)鈣離子水平，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)VSMCs內(nèi)目的基因(smad1、runx2 mRNA)表達(dá)水平。細(xì)胞接受14 d干預(yù)后進(jìn)行鈣化檢測(cè)，包括鈣水平測(cè)定和茜素紅染色情況。結(jié)果 高磷組、維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平均低于高磷組(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平分別高于2 d后(P<0.05)；高磷組6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平高于4 d后(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平低于4 d后(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均低于高磷組(P<0.05)。高磷組4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平分別高于2 d后，6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平分別高于4 d后(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組4 d后VSMCs內(nèi)smad1 mRNA表達(dá)水平高于2 d后，runx2 mRNA表達(dá)水平低于2 d后，6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均高于2、4 d后(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組VSMCs鈣水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組VSMCs鈣水平低于高磷組(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)較正常對(duì)照組多，維拉帕米干預(yù)組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)較高磷組少。結(jié)論 維拉帕米在高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中起抑制作用，其可能是通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流進(jìn)而抑制smad1表達(dá)，進(jìn)一步抑制runx2表達(dá)，進(jìn)而抑制VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

維拉帕米；肌細(xì)胞,平滑肌；血管鈣化；鈣通道

李同妙，徐金升，馮雨，等.維拉帕米通過(guò)阻斷鈣離子內(nèi)流抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(27)：3294-3299.[www.chinagp.net]

Li TM,Xu JS,Feng Y,et al.Inhibition of the calcification of vascular smooth muscle cells by verapamil though the blocking of the inward flow of calcium ion[J].Chinese General Practice，2015，18(27)：3294-3299.

心血管疾病是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者死亡的首位原因，血管鈣化與心血管疾病的高發(fā)病率密切相關(guān)[1]。不同于傳統(tǒng)的血管鈣化，CKD患者血管鈣化主要發(fā)生在動(dòng)脈中膜，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發(fā)生類(lèi)成骨/成軟骨表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化的重要機(jī)制[2]。血管平滑肌的鈣離子作為重要的第二信使可以推動(dòng)血管鈣化[3]。維拉帕米作為第一類(lèi)鈣通道阻滯劑，通過(guò)阻斷鈣通道發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管壁等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)有顯著保護(hù)功能[4]。早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，維拉帕米可以抑制維生素D誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈鈣化[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素K[6]、γ干擾素[7]、鎂離子[8]可抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)以高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化為模型，維拉帕米為干預(yù)因素，探討維拉帕米抑制血管鈣化發(fā)生過(guò)程中的可能作用和機(jī)制，為血管鈣化的治療提供新思路和治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2014年12月—2015年6月選取5～8周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量80～100 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證標(biāo)號(hào)：1305090。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 倒置相差顯微鏡(LH50A型，日本OLYMPUS公司)，酶標(biāo)儀(CYTATION3型，

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

(1)維拉帕米在臨床上多用于治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病，在血管鈣化方面鮮有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)維拉帕米可以抑制血管鈣化發(fā)生，是本文一大創(chuàng)新點(diǎn)。

(2)本研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米是通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑制血管鈣化作用的。

(3)維拉帕米在血管鈣化方面的作用，可能給臨床上治療血管鈣化提供新思路，對(duì)于有血管鈣化和高血壓的慢性腎臟病患者而言，或許合理應(yīng)用維拉帕米可以同時(shí)起到治療高血壓和血管鈣化的作用。

美國(guó)BioTek公司)，胎牛血清(FBS，美國(guó)GIBCO公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，免疫組化試劑盒(河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)，鈣水平測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)，RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(ABI5700型，美國(guó)ABI公司)，PCR引物〔英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司〕，鈣離子熒光探針Fluo-3/AM(美國(guó)Sigma)。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠VSMCs傳代培養(yǎng) 大鼠均給予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡后在無(wú)菌條件下分離出胸主動(dòng)脈，剝?nèi)ネ饽?，縱向剪開(kāi)管壁，然后用紗布輕輕擦除內(nèi)膜，將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊，放置在含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液。此后每隔2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，直至細(xì)胞接近80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。此后每隔3～4 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞鑒定及實(shí)驗(yàn)分組 應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、排列方式和生長(zhǎng)特點(diǎn)等。免疫組化染色：在6孔板中采用消毒的蓋玻片制作細(xì)胞玻片，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1～2次，爬片用95%乙醇固定30 min，PBS洗滌2次(每次2 min)，免疫組化法檢測(cè)VSMCs特異性抗體α-SMA actin，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)分化、脫水、透明、封片后，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)棕黃色免疫產(chǎn)物即可判定為陽(yáng)性結(jié)果，表明細(xì)胞傳代純化，為VSMCs。將對(duì)數(shù)期VSMCs隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高磷組、維拉帕米干預(yù)組，正常對(duì)照組采用含10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，高磷組采用高磷培養(yǎng)基(含10 mmol/L β-甘油磷酸)培養(yǎng)，維拉帕米干預(yù)組在高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入維拉帕米至濃度為20 mmol/L，此后每隔2 d換液1次。

1.2.3 VSMCs內(nèi)鈣離子水平測(cè)定 按照文獻(xiàn)[9]方法，細(xì)胞接受2、4、6 d干預(yù)后，檢測(cè)VSMCs內(nèi)鈣離子水平。PBS洗滌細(xì)胞后，以1 000 r/min離心5 min(離心半徑8.6 cm)，棄上清液，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液洗滌細(xì)胞，懸浮，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為200×106/L～300×106/L，細(xì)胞懸液中加入Fluo-3/AM，終濃度為5 μmol/L，37 ℃下避光負(fù)載30 min；維拉帕米加入方式：負(fù)載Fluo-3/AM的細(xì)胞懸液加入20 μmol/L維拉帕米孵育15 min，以80 mmol/L 氯化鉀溶液為激動(dòng)劑，細(xì)胞懸液置于96孔板內(nèi)，依據(jù)上述分組，每組設(shè)置對(duì)照孔，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為325 nm，于526 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)，因細(xì)胞內(nèi)鈣離子同F(xiàn)luo-3/AM結(jié)合后發(fā)出熒光，且FI和游離鈣離子水平呈正比[9]，因此本研究采用Fluo-3/AM FI間接反映出細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為3次平均值。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)VSMCs內(nèi)目的基因表達(dá)水平 細(xì)胞接受2、4、6 d干預(yù)后，利用RNA提取試劑盒，采用Trizol法提取并純化細(xì)胞總RNA。應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，smad1 55 ℃退火30 s、GAPDH 58 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，36個(gè)循環(huán)；runx2 55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，28個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物，行瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為3次平均值。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算目的基因表達(dá)水平。各基因擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 鈣化檢測(cè)

1.2.5.1 VSMCs鈣水平測(cè)定 采用鈣水平測(cè)定試劑盒檢測(cè)VSMCs鈣水平：細(xì)胞接受14 d干預(yù)后棄去上清液，加入1 mol/L鹽酸溶液脫鈣，37 ℃過(guò)夜，取上清液測(cè)定鈣水平，0.1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)和0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液溶解細(xì)胞30 min，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白水平，結(jié)果用細(xì)胞鈣水平比蛋白水平表示(mg/g蛋白)。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.2.5.2 茜素紅染色 細(xì)胞接受14 d干預(yù)后采用茜素紅進(jìn)行鈣化染色，倒置相差顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)染色情況，每組取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取1個(gè)視野(×100)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積為橘紅色。

表1 各目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定 大鼠胸主動(dòng)脈組織塊貼壁3～4 d后見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，呈束狀排列，5～6 d成同心圓狀細(xì)胞團(tuán)，形成明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)暈，環(huán)繞組織塊邊緣呈束狀、向外呈放射狀延伸，約6～7 d后融合成片，細(xì)胞體為不規(guī)則三角形或梭形，細(xì)胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中有卵圓形核，細(xì)胞貼壁呈極性生長(zhǎng)，高低起伏，呈典型的“峰-谷”樣表現(xiàn)。細(xì)胞質(zhì)α-SMA actin表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。細(xì)胞傳代純化，細(xì)胞生長(zhǎng)特性無(wú)明顯改變。

2.2 3組VSMCs內(nèi)鈣離子水平比較 2、4、6 d后，3組大鼠VSMCs內(nèi)鈣離子水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平均低于高磷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平高于2 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高磷組6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平高于4 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平低于4 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

Table 2 Comparison of the calcium ion level of rat VSMCs among the three groups

組別2d后4d后6d后正常對(duì)照組15766±270214954±208914500±1374高磷組43166±2286a43833±750ac44167±1724acd維拉帕米干預(yù)組23023±2057ab23800±1228abc23333±1071abcdF值189084407621151378P值<001<0010029

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與高磷組比較，bP<0.05;與2 d后比較，cP<00.05；與4 d后比較，dP<00.05

2.3 3組VSMCs內(nèi)目的基因表達(dá)水平比較 2、4、6 d后，3組VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均低于高磷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高磷組4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平高于2 d后，6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平高于4 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組4 d后VSMCs內(nèi)smad1 mRNA表達(dá)水平高于2 d后，runx2 mRNA表達(dá)水平低于2 d后，6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均高于2、4 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3、圖1)。

2.4 鈣化檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 3組VSMCs鈣水平比較 3組VSMCs鈣水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高磷組、維拉帕米干預(yù)組VSMCs鈣水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維拉帕米干預(yù)組VSMCs鈣水平低于高磷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表4)。

2.4.2 茜素紅染色結(jié)果 高磷組、維拉帕米干預(yù)組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)較正常對(duì)照組多，維拉帕米干預(yù)組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)較高磷組少(見(jiàn)圖2)。

注：A為正常對(duì)照組，B為高磷組，C為維拉帕米干預(yù)組

圖1 3組大鼠VSMCs內(nèi)smad1和runx2 mRNA表達(dá)情況

Figure 1 Expression of smad1 and runx2 mRNA of rat VSMCs among the three groups

表3 3組大鼠VSMCs內(nèi)目的基因表達(dá)水平比較(±s,n=3)

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與高磷組比較，bP<0.05；與2 d后比較，cP<0.05；與4 d后比較，dP<0.05

圖2 3組大鼠VSMCs鈣化結(jié)節(jié)的形成(茜素紅染色，×100)

組別鈣水平(mg/g蛋白)正常對(duì)照組4479±638高磷組17652±1286a維拉帕米干預(yù)組13023±1057abF值20964P值0020

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與高磷組比較，bP<0.05

3 討論

血管鈣化普遍存在于CKD患者當(dāng)中，研究顯示，40%～60%的CKD 3～5期患者出現(xiàn)主動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈鈣化[10]。血管鈣化是主動(dòng)的、受多種基因調(diào)節(jié)的類(lèi)成骨過(guò)程，常伴有runx2、堿性磷酸酶等骨相關(guān)蛋白表達(dá)[2]。鈣離子作為VSMCs重要的第二信使，參與細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、表型轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流入細(xì)胞，可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、加速基質(zhì)小泡釋放、促進(jìn)鈣磷沉積、推動(dòng)VSMCs表型轉(zhuǎn)化等多種機(jī)制來(lái)參與血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展[3]。維拉帕米屬于苯烷胺類(lèi)的鈣通道阻滯劑，通過(guò)特異性結(jié)合L型鈣通道的α亞基，起到抑制L型鈣通道介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流的作用[11]?；诰S拉帕米的作用機(jī)制，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米在治療動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌缺血/再灌注損傷等方面發(fā)揮重要作用，有顯著保護(hù)心血管的效應(yīng)[4]，然而在血管鈣化方面的研究卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，維拉帕米干預(yù)組VSMCs鈣水平、橘紅色鈣化結(jié)節(jié)均低于高磷組，提示維拉帕米抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米可以通過(guò)濃度依賴(lài)方式抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，同本研究結(jié)果相似。

VSMCs內(nèi)的鈣離子連同其下游的信號(hào)分子構(gòu)成龐大的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)。有學(xué)者研究顯示，在成骨細(xì)胞上，通過(guò)鈣通道內(nèi)流入細(xì)胞的鈣離子可以啟動(dòng)下游骨相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成[12]。VSMCs成骨轉(zhuǎn)分化是血管鈣化的重要機(jī)制[3]，因此推測(cè)在VSMCs鈣化過(guò)程中，鈣離子發(fā)揮類(lèi)似作用。維拉帕米作為鈣通道阻滯劑可以通過(guò)阻斷細(xì)胞膜上鈣離子通道，減少鈣離子內(nèi)流，從而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。本研究結(jié)果顯示，高磷組、維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平均高于正常對(duì)照組，維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)鈣離子水平均低于高磷組，提示維拉帕米可有效抑制鈣離子內(nèi)流。

血管平滑肌發(fā)生成骨/成軟骨表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化的重要機(jī)制之一[2]。runx2是成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別多種成骨特異的基因啟動(dòng)子中的特異性順式作用元件，調(diào)控成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，是VSMCs表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[3]。相關(guān)研究顯示，鈣離子可以通過(guò)smad1調(diào)節(jié)runx2表達(dá)，鈣離子通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子smad1的絲氨酸磷酸化，活化的smad1蛋白易位至胞核內(nèi)進(jìn)而調(diào)控smad1蛋白的目的基因轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)runx2的表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示，高磷組、維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，維拉帕米干預(yù)組2、4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均低于高磷組，高磷組4、6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平分別高于2 d后，6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平分別高于4 d后，維拉帕米干預(yù)組4 d后VSMCs內(nèi)smad1 mRNA表達(dá)水平高于2 d后，runx2 mRNA表達(dá)水平低于2 d后，6 d后VSMCs內(nèi)smad1、runx2 mRNA表達(dá)水平均高于2、4 d后，說(shuō)明高磷是以時(shí)間依賴(lài)的方式上調(diào)runx2和smad1的表達(dá)，提示維拉帕米通過(guò)阻斷鈣離子內(nèi)流從而抑制smad1表達(dá)，進(jìn)而抑制runx2的表達(dá)，最終抑制VSMCs鈣化。

綜上所述，維拉帕米在高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中起到抑制作用，為臨床治療血管鈣化提供了新思路，維拉帕米這種作用可能是通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流進(jìn)而抑制smad1表達(dá)，進(jìn)一步抑制runx2表達(dá)，進(jìn)而抑制VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但本研究?jī)H局限在基因水平，而其蛋白水平如何變化，尚有待進(jìn)一步探討。

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(本文編輯：崔麗紅)

Inhibition of the Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells by Verapamil Though the Blocking of the Inward Flow of Calcium Ion

LITong-miao,XUJin-sheng,FENGYu,etal.

DepartmentofNephrology,theForthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Objective To explore the effect and mechanism of verapamil on the calcification of vascular smooth muscle cells(VSMCs) induced by hyperphosphate.Methods From December 2014 to June 2015,selecte 6 healthy male SD rats of 5 to 8 weeks and cleaning grade vascular smooth muscle cells were cultured in vitro and were determined by immunohistochemistry.The VSMCs in logarithmic phrase were randomly divided into normal control group(10% FBS culture medium),hyperphosphate group(hyperphosphate culture medium) and verapamil group(hyperphosphate culture medium+20 nmol/L verapamil).Deteation of intracelluar calcium ion level of VSMCs after culture for 2,4 and 6 days.RT-PCR was used to observe the expression of VSMCs smad1 and runx2 mRNA after culture for 2,4,6 days.After culture for 14 days,calcification test was conducted,including calcium level measurement and alizarin red staining.Results After culture for 2,4 and 6 days,the hyperphosphate group and verapamil group were higher(P<0.05) than normal control group in calcium ion level of VSMCs;after culture for 2,4 and 6 days,verapamil group was lower(P<0.05) than hyperphosphate group in calcium ion level of VSMCs.After culture for 4 and 6 days,hyperphosphate group and verapamil group had higher(P<0.05) calcium ion level of VSMCs than that after culture for 2 days;hyperphosphate group had higher(P<0.05) calcium ion level of VSMCs after culture for 6 days than that after culture for 4 days;verapamil group had lower(P<0.05) calcium ion level of VSMCs after culture for 6 days than that after culture for 4 days.After culture for 2,4 and 6 days hyperphosphate group and verapamil group were higher(P<0.05) than normal control group in the expression of VSMCs smad1 and runx2 mRNA;after culture for 2,4 and 6 days,verapamil group was lower(P<0.05) than hyperphosphate group in the expression of VSMCs smad1 and runx2 mRNA.Hyperphosphate group had higher(P<0.05) expression of VSMCs smad1 and runx2 mRNA after culture for 4 days and 6 days than that after culture for 2 days and had higher(P<0.05) expression of VSMCs smad1 and runx2 mRNA after culture for 6 days than that after culture for 4 days;verapamil group had higher (P<0.05) expression of VSMCs smad1 mRNA and lower (P<0.05) expression of VSMCs runx2 mRNA after culture for 4 days than that after culture for 2 days;verapamil group had higher (P<0.05) expression of VSMCs smad1 and runx2 mRNA after culture for 6 days than that after culture for 2 days and 4 days.Hyperphosphate group and verapamil group had higher(P<0.05) calcium level of VSMCs than normal control group,verapamil group was lower(P<0.05) than hyperphosphate group in calcium level.Hyperphosphate group and verapamil group had more orange calcification nodules than normal control group;verapamil group had less orange calcification nodules than hyperphosphate group.Conclusion Verapamil may protect against hyperphosphate-induced calcification of VSMCs and may inhibit VSMCs phenotypic transformation by downregulating smad1 expression and further inhibiting runx2 expression.

Verapamil;Myocytes,smooth muscle;Vascular calcification;Calcium channels

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：H2012206157)

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科

徐金升，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail：xjs5766@126.com

R 364

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.27.008

2015-06-09；

2015-07-22)