化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)機(jī)制研究

唐 振，李世杰，王穎飛，夏 凱，侯曉利，張 聰，葉震中，曹紅春

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·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)機(jī)制研究

唐 振，李世杰，王穎飛，夏 凱，侯曉利，張 聰，葉震中，曹紅春

目的 觀察化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法 2013年9月2—21日，利用SPSS統(tǒng)計軟件采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠隨機(jī)分為6組，即對照組、模型組、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)組、化療減毒湯低劑量組(10 g原生藥/kg)、化療減毒湯中劑量組(20 g原生藥/kg)及化療減毒湯高劑量組(30 g原生藥/kg)，每組10只。對照組給予低蛋白飼料；模型組給予低蛋白飼料并腹腔注射環(huán)磷酰胺；G-CSF組給予低蛋白飼料，腹腔注射環(huán)磷酰胺，皮下注射G-CSF；化療減毒湯低、中、高劑量組給予低蛋白飼料，灌胃化療減毒湯，腹腔注射環(huán)磷酰胺。末次給藥后24 h檢測各組小鼠IL-1α、IL-6水平、造血干細(xì)胞免疫表型(CD34-LSK)細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比及外周血細(xì)胞數(shù)量〔紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)、血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)計數(shù)、血小板(PLT)計數(shù)、中性粒細(xì)胞(NEUT)計數(shù)、NEUT分?jǐn)?shù)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)計數(shù)、LYMPH分?jǐn)?shù)、單核細(xì)胞(MONO)計數(shù)、MONO分?jǐn)?shù)、嗜堿粒細(xì)胞(BASO)計數(shù)、BASO分?jǐn)?shù)、嗜酸粒細(xì)胞(EO)計數(shù)、EO分?jǐn)?shù)〕。結(jié)果 模型組IL-1α水平、RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組(P<0.05)；G-CSF組IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、NEUT分?jǐn)?shù)、MONO分?jǐn)?shù)高于對照組，RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、LYMPH分?jǐn)?shù)低于模型組，WBC、NEUT分?jǐn)?shù)高于模型組(P<0.05)；化療減毒湯低劑量組IL-1α水平、RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，LYMPH高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組(P<0.05)；化療減毒湯中劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，WBC、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-1α水平高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組(P<0.05)；化療減毒湯高劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-1α水平、WBC、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，IL-1α水平、PLT高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組(P<0.05)。結(jié)論 化療減毒湯中、高劑量具有很好的對抗環(huán)磷酰胺致骨髓抑制作用，在降低環(huán)磷酰胺對骨髓造血干細(xì)胞慢性毒性方面，化療減毒湯優(yōu)于G-CSF，其機(jī)制可能與調(diào)整IL-1α、IL-6水平、降低CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞的百分比有關(guān)。

環(huán)磷酰胺；化療減毒湯；骨髓抑制

唐振，李世杰，王穎飛，等.化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(27)：3360-3365.[www.chinagp.net]

Tang Z,Li SJ,Wang YF,et al.Protective mechanism of chemotherapy attenuation soup for rats with cyclophosphamide-induced bone marrow suppression[J].Chinese General Practice，2015，18(27)：3360-3365.

化療是目前治療惡性腫瘤的主要方法之一，骨髓抑制是化療最常見的劑量限制性反應(yīng)，外周血象改變是化療藥物對骨髓抑制的主要外周表現(xiàn)[1]，目前臨床上使用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素(IL)11、促紅細(xì)胞生成素等生物制劑對化療后骨髓抑制進(jìn)行對抗；但此類藥物僅能促進(jìn)血象中的一種細(xì)胞恢復(fù)，促進(jìn)短期造血重建干細(xì)胞和較晚的祖細(xì)胞增殖，加之常有發(fā)熱、骨痛等毒副作用，長期大量使用還會刺激惡性細(xì)胞生長并增加白血病患病的風(fēng)險[2]。因此，如何減輕化療藥物對機(jī)體的損傷，特別是對骨髓的抑制，是醫(yī)務(wù)工作者長期以來追求的目標(biāo)?；煖p毒湯是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科李世杰教授總結(jié)出來的中藥復(fù)方，在辨證論治基礎(chǔ)上根據(jù)患者個體情況如舌象、脈相等加減運用，以緩解腫瘤患者化療后骨髓抑制，收效頗佳[3]。為探討其具體機(jī)制，本研究以環(huán)磷酰胺腹腔注射建立小鼠骨髓抑制模型，分別運用低、中、高劑量化療減毒湯和G-CSF進(jìn)行治療，觀察小鼠外周血象變化，計數(shù)小鼠骨髓中造血干細(xì)胞免疫表型(CD34-c-Kit+Sca-1+lineage marker，CD34-LSK)細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比[4]，分析小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖情況，以期從細(xì)胞、分子水平證實本治療方法的科學(xué)性，為臨床治療、新藥研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物 化療減毒湯(黃芪60 g、人參30 g、當(dāng)歸20 g、白術(shù)10 g、生甘草10 g、阿膠5 g、龜板膠5 g、鹿角膠5 g，組方中藥物為免煎中藥顆粒，棕黃色，1 g相當(dāng)于原生藥1.292 g)由獲得藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)認(rèn)證的四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司制成、成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院免煎中藥房提供，使用時溶于400 ml煮沸過的飲用水，攪拌使藥液混合均勻。藥液終體積為414 ml，即1.87 g原生藥/ml。本實驗劑量按原生藥g/kg計算。注射用環(huán)磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司，批號：130105)臨用前配制。G-CSF注射液(齊魯制藥有限公司，批號：201304016TC)。

1.1.2 主要檢測試劑 Anti-Mouse CD34eFluor 660(規(guī)格100 μg，eBioscience)，IL-1α酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒〔批號：C22031492，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司〕，IL-6 ELISA試劑盒〔批號：C30031493，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司〕。

1.1.3 動物 KM雄性小鼠60只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，動物合格證編號：SCXK(川)2008-19。自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供。本研究經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.1.4 主要儀器 血細(xì)胞分析儀(XT-2000iv，sysmex公司)，流式細(xì)胞儀(navios，Beckman Coulter)，JA1003A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。

1.1.5 實驗環(huán)境 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所SPF屏障系統(tǒng)。室內(nèi)溫度20～22 ℃，相對濕度52%左右，24 h明暗交替照明。合格證號SYXK(川)2013-100。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥方法 2013年9月2—21日，利用SPSS統(tǒng)計軟件采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為6組，即對照組、模型組、G-CSF組、化療減毒湯低劑量組(10 g原生藥/kg)、化療減毒湯中劑量組(20 g原生藥/kg)及化療減毒湯高劑量組(30 g原生藥/kg)，每組10只。對照組從第1天給予自制低蛋白飼料(玉米粉+小麥粉)，連續(xù)17 d；模型組給予低蛋白飼料，連續(xù)17 d，從第8天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，隔天1次，連續(xù)3次；G-CSF組給予低蛋白飼料，連續(xù)17 d，從第8天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，隔天1次，連續(xù)3次，第14～16天皮下注射G-CSF 50 μg/kg，1次/d，連續(xù)3 d；化療減毒湯低、中、高劑量組給予低蛋白飼料，同時每天上午同一時間灌胃給藥1次(用JA1003A電子天平對小鼠進(jìn)行稱重以確定每只小鼠所需中藥劑量，然后進(jìn)行灌胃給藥)，連續(xù)17 d，從第8天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，連續(xù)3 d。

本文研究價值：

(1)化療減毒湯中、高劑量具有很好的對抗環(huán)磷酰胺致骨髓抑制作用，在降低環(huán)磷酰胺對骨髓造血干細(xì)胞慢性毒性方面，化療減毒湯優(yōu)于重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其機(jī)制可能與調(diào)整白介素(IL)1α、IL-6水平，降低造血干細(xì)胞免疫表型(CD34-LSK)細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比有關(guān)。

(2)本方為李世杰教授根據(jù)自己多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)出來的中藥復(fù)方，臨床運用安全有效，適宜長期運用。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 IL-1α、IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比檢測 末次給藥后24 h，尾靜脈取血，采用ELISA法檢測其IL-1α、IL-6水平；處死小鼠，取雙側(cè)股骨，用Anti-Mouse CD34eFluor 660試劑標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測CD34-LSK細(xì)胞數(shù)，并計算各組CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比[4-5]。

1.2.2.2 外周血細(xì)胞數(shù)量檢測 末次給藥后24 h，尾靜脈取血，采用血細(xì)胞分析儀測定其相關(guān)血象：紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)、血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)計數(shù)、血小板(PLT)計數(shù)、中性粒細(xì)胞(NEUT)計數(shù)、NEUT分?jǐn)?shù)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)計數(shù)、LYMPH分?jǐn)?shù)、單核細(xì)胞(MONO)計數(shù)、MONO分?jǐn)?shù)、嗜堿粒細(xì)胞(BASO)計數(shù)、BASO分?jǐn)?shù)、嗜酸粒細(xì)胞(EO)計數(shù)、EO分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 IL-1α、IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比比較 各組IL-1α、IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組IL-1α水平低于對照組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G-CSF組IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯低劑量組IL-1α水平低于對照組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯中劑量組IL-1α水平高于模型組和化療減毒湯低劑量組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組、G-CSF組及化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯高劑量組IL-1α水平高于模型組、G-CSF組及化療減毒湯低劑量組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組、G-CSF組及化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of the levels of IL-1α and IL-6 and the percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells among 6 groups

組別IL-1α(pg/ml)IL-6(pg/ml)CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比(%)對照組176±061251±052073±039模型組089±016b371±028b556±284bG-CSF組125±048304±052bc525±173b化療減毒湯低劑量組113±051b324±053bc647±388b化療減毒湯中劑量組179±045ce227±049cde042±017cde化療減毒湯高劑量組172±042cde227±040cde053±017cdeF/Z值6968a1587618251P值<0001<0001<0001

注：G-CSF=重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，IL-1α=白介素1α，IL-6=白介素6，CD34-LSK=造血干細(xì)胞免疫表型；a為Z值；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與G-CSF組比較，dP<0.05；與化療減毒湯低劑量組比較，eP<0.05

2.2 各組外周血細(xì)胞數(shù)量比較 各組RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、MONO、MONO分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組BASO、BASO分?jǐn)?shù)、EO比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G-CSF組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，NEUT分?jǐn)?shù)、MONO分?jǐn)?shù)高于對照組，WBC、NEUT分?jǐn)?shù)高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯低劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，LYMPH高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯中劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，WBC、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，PLT高于化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯高劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，WBC、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，PLT高于化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

3 討論

化療藥物對骨髓的作用主要表現(xiàn)為急性作用和慢性作用，而環(huán)磷酰胺是代表藥物。環(huán)磷酰胺對骨髓的慢性作用主要表現(xiàn)在抑制骨髓干細(xì)胞的功能[5]，而其急性作用則表現(xiàn)為兩方面，一是直接破壞血細(xì)胞，使其數(shù)量迅速降低；二是環(huán)磷酰胺對骨髓造血干細(xì)胞具有一定的動員作用，這種動員作用可導(dǎo)致骨系成骨細(xì)胞(bone-lining osteoblasts)消失或形象改變，導(dǎo)致其功能減退，這些現(xiàn)象與其能夠減少基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)、干細(xì)胞因子(SCF)以及血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[6]。而造血干細(xì)胞是血液成分之一，是生成各種血細(xì)胞的最起始細(xì)胞，存在于骨髓、外周血、胚肝中，具有進(jìn)一步分化各系統(tǒng)祖細(xì)胞的能力。CD34抗原選擇地表達(dá)于造血祖細(xì)胞膜上，是造血干細(xì)胞的標(biāo)志[7]。既往實驗研究表明，CD34在造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞上存在，能夠特異性結(jié)合IL-1α、IL-6、IL-3以及G-CSF等細(xì)胞因子的受體[8]。de Revel等[9]將反轉(zhuǎn)錄IL-1α轉(zhuǎn)移到恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞，使其表達(dá)IL-1α，結(jié)果顯示，IL-1α表達(dá)的同時，G-CSF以及人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)生成顯著增加，其外周血WBC也輕度升高。提示IL-1α有一定刺激骨髓細(xì)胞形成的作用，IL-1α可顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞支持造血作用，這種作用來源于上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-6對造血干細(xì)胞的作用則是多方面的，一方面，IL-6具有刺激造血干細(xì)胞生長、分化和協(xié)同IL-3促進(jìn)造血干細(xì)胞分化和促巨核細(xì)胞成熟等作用；另一方面，IL-6還有促進(jìn)造血干細(xì)胞歸巢的作用。Cardier等[10]用IL-3、IL-6、IL-11和鐵因子共同處理小鼠造血干細(xì)胞24～48 h發(fā)現(xiàn)，這些因子能協(xié)調(diào)并促進(jìn)造血干細(xì)胞向肺癌組織歸巢，遷移率大于對照組，并且轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞的比例增加。另外，IL-1、IL-3能聯(lián)合啟動造血干細(xì)胞的早期增殖，而IL-6能阻止這一現(xiàn)象[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-1α水平、RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比，提示模型組造模成功，其骨髓干細(xì)胞動員明顯增加，外周血細(xì)胞數(shù)量的變化可能與注射環(huán)磷酰胺后影響IL-1α水平及IL-6水平進(jìn)而引起骨髓造血干細(xì)胞的慢性抑制作用相關(guān)，同文獻(xiàn)報道一致[5]。G-CSF組IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、NEUT分?jǐn)?shù)、MONO分?jǐn)?shù)高于對照組，RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比與模型組無差異，WBC、NEUT分?jǐn)?shù)高于模型組，IL-6水平、LYMPH分?jǐn)?shù)低于模型組，提示G-CSF能夠用于化療后骨髓抑制，能夠刺激骨髓干細(xì)胞動員[12]，但不能從根本上保護(hù)造血干細(xì)胞功能，不適宜長期運用。

表2 各組小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量比較(±s，n=10)

注：RBC=紅細(xì)胞，Hb=血紅蛋白，WBC=白細(xì)胞，PLT=血小板，NEUT=中性粒細(xì)胞，LYMPH=淋巴細(xì)胞，MONO=單核細(xì)胞，BASO=嗜堿粒細(xì)胞，EO=嗜酸粒細(xì)胞；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與G-CSF組比較，dP<0.05；與化療減毒湯低劑量組比較，eP<0.05

本研究結(jié)果顯示，化療減毒湯低劑量組IL-1α水平、RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，LYMPH高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組；化療減毒湯中劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-1α水平高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，WBC、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組，PLT高于化療減毒湯低劑量組；化療減毒湯高劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-1α水平、WBC、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，IL-1α水平、PLT高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組。提示化療減毒湯中、高劑量可拮抗環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的骨髓抑制，具有升高環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制小鼠WBC的作用，且效果優(yōu)于G-CSF，臨床可運用于需行化療或化療后WBC降低的患者。其機(jī)理可能是其通過增加實驗小鼠血液中的IL-1α水平，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞支持造血干細(xì)胞的分化及增殖功能，促進(jìn)其造血干細(xì)胞功能及外周血象的恢復(fù)；同時通過降低其IL-6水平，導(dǎo)致造血干細(xì)胞歸巢的作用、減弱IL-6抑制其他細(xì)胞因子對造血干細(xì)胞功能的抑制作用，這幾方面的綜合結(jié)果導(dǎo)致化療減毒湯在不損傷造血干細(xì)胞儲備的情況下，將外周血象維持在較高水平。

根據(jù)化療后骨髓抑制常見的乏力、頭暈、發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”“血虛”范疇。化療后脾腎受損，脾虛則氣血生化乏源，腎虧則精血生化無根，基于陰陽互根、五臟相關(guān)、氣血同源等理論，氣虛不能生血，血虛不能化氣，氣虛者陽漸衰，血虛者陰漸虧，終致脾腎不足，氣血兩虧[13]?！稄埵厢t(yī)通》[14]有云：“人之虛，非氣即血，五臟六腑莫能外焉。而血之源頭在乎腎，氣之源頭在乎脾。”可見化療骨髓抑制患者的關(guān)鍵病理機(jī)制是脾腎不足，故治療應(yīng)從脾腎入手?；熃舛緶侵委熁熀蠊撬枰种频慕?jīng)驗方，方中黃芪、人參大補元氣，健脾益氣為君，當(dāng)歸補血活血、白術(shù)健脾益氣，使補而不滯為丞，佐以阿膠、鹿角膠、龜板膠補血益精滋腎，甘草調(diào)和諸藥，共奏健脾益腎，補氣益血之功。趙靜梅[15]研究表明，補氣、養(yǎng)血、益腎之法具有解除化療后骨髓細(xì)胞G1期阻滯的作用，能增加造血干祖細(xì)胞的數(shù)量，對骨髓有核細(xì)胞計數(shù)及紅系、粒系、巨系等的恢復(fù)具有較好作用。補腎解毒活血中藥可通過促進(jìn)骨髓造血祖細(xì)胞集落生成能力，促進(jìn)造血細(xì)胞的生成[16-17]。本研究所采用的化療減毒湯方中人參所含的多糖、皂甙可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞造血細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)[18]；黃芪具有減輕貧血動物模型的貧血程度、促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和分化的作用，當(dāng)歸多糖可進(jìn)而促進(jìn)粒單系血細(xì)胞的生成[19]；阿膠活性組分能夠有效地保護(hù)骨髓造血微環(huán)境，減輕環(huán)磷酰胺對骨髓組織的損傷，保護(hù)造血組織[20]；白術(shù)有抗腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并可調(diào)節(jié)腫瘤患者胃腸功能[21]。

顯然，本研究也存在一定的不足之處。首先，本研究未能完全揭示化療減毒湯中、高劑量升高外周血WBC、PLT的具體機(jī)制，也未能揭示本方升高外周血WBC、PLT的最佳劑量及最佳時機(jī)；其次，本研究樣本量仍偏小，實驗時間較短，今后如能開展針對療效機(jī)制、量效機(jī)制的多中心、大樣本、隨訪時間較長的基礎(chǔ)研究、臨床隊列研究可望得到更有說服力的結(jié)果。

綜上所述，化療減毒湯能改善環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓抑制，在骨髓造血干細(xì)胞慢性毒性方面，化療減毒湯明顯優(yōu)于G-CSF，值得推廣。但其詳細(xì)作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯：崔麗紅)

Protective Mechanism of Chemotherapy Attenuation Soup for Rats With Cyclophosphamide-induced Bone Marrow Suppression

TANGZhen,LIShi-jie,WANGYing-fei,etal.

SchoolofClinicalMedicine,ChengduUniversityofT.C.M,Chengdu610072,China

Objective To observe the protective mechanism of chemotherapy attenuation soup for rats with cyclophosphamide-induced bone marrow suppression.Methods From September 2 to 21 in 2013,using SPSS statistic software,60 rats were equally divided into 6 groups:control group,model group,G-CSF group,low-dose chemotherapy attenuation soup group (10 g crude drug/kg),medium-dose chemotherapy attenuation soup group (20 g crude drug/kg) and high-dose chemotherapy attenuation soup group (30 g crude drug/kg).Control group was given low protein feed;model group was given low protein feed and cyclophosphamide by intraperitoneal injection;G-CSF group was given low protein feed,cyclophosphamide by intraperitoneal injection and G-CSF by subcutaneous injection;low-dose chemotherapy attenuation soup group,medium-dose chemotherapy attenuation soup group and high-dose chemotherapy attenuation soup group were given low protein feed,chemotherapy attenuation soup by gavage and cyclophosphamide by intraperitoneal injection.24 hours after the last drug administration,examined levels of IL-1α and IL-6,percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells,RBC,Hb,WBC,PLT,NEUT,NEUT score,LYMPH,LYMPH score,MONO,MONO score,BASO,BASO score,EO and EO score.Results Model group was lower(P<0.05) in the level of IL-1α,RBC,Hb,WBC，PLT,NEUT,LYMPH,LYMPH score,EO score and higher (P<0.05) in the level of IL-6,percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than control group;G-CSF group was higher (P<0.05) in the level of IL-6,the percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells,NEUT score and MONO score and higher (P<0.05) in RBC,Hb，LYMPH score and EO score than control group;G-CSF group was lower(P<0.05) in the level of IL-6 and LYMPH score and higher (P<0.05) in WBC and NEUT score than model group;low-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in the level of IL-1α,RBC,Hb,LYMPH score and EO score and higher (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than control group;low-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in the level of IL-6 and higher (P<0.05) in LYMPH than model group;low-dose chemotherapy attenuation soup group was higher(P<0.05) in LYMPH score than G-CSF group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in RBC,Hb,LYMPH score and EO score and higher (P<0.05) in WBC,NEUT and NEUT score than control group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α,WBC,PLT,NEUT,NEUT score and LYMPH and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than model group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells and MONO score and higher (P<0.05) in WBC and LYMPH score than G-CSF group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than low-dose chemotherapy attenuation soup group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in RBC,Hb and LYMPH score and higher (P<0.05) in WBC,NEUT score than control group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α,WBC,PLT,NEUT,NEUT score and LYMPH and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than model group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α,WBC,LYMPH and LYMPH score and lower (P<0.05) in the level of IL-6,percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells and MONO score than G-CSF group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α and PLT and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than low-dose chemotherapy attenuation soup group.Conclusion Medium-dose and high-dose chemotherapy attenuation soup have good protective effect against bone marrow suppression induced by cyclophosphamide.Chemotherapy attenuation soup is superior to G-CSF in reducing the chronic toxicity brought by cyclophosphamide in bone marrow hematopoietic stem cells.The mechanism is probably that it can adjust IL-1α and IL-6 levels and reduce the percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells.

Cyclophosphamide;Chemotherapy attenuation soup;Bone marrow suppression

四川省科技支撐計劃項目(2011SZ0312)

610072 四川省成都市，成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(唐振，王穎飛，夏凱，侯曉利，張聰，葉震中，曹紅春)；成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(李世杰)

李世杰，610072 四川省成都市，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；E-mail：chinajef@126.com

R 551.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.27.022

2015-02-25；

2015-05-15)