血管內(nèi)皮生長因子激酶功能區(qū)受體基因沉默抑制肺癌A549細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其對多西他賽的敏感性

張秀義

·基礎(chǔ)研究·

血管內(nèi)皮生長因子激酶功能區(qū)受體基因沉默抑制肺癌A549細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其對多西他賽的敏感性

張秀義

目的研究沉默血管內(nèi)皮生長因子激酶功能區(qū)受體(kinase-domain insert containing receptor,KDR)基因?qū)θ朔伟〢549細(xì)胞增殖以及對化療藥物多西他賽敏感性的影響。方法設(shè)計合成KDR的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)序列，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞。通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和Western Blot檢測KDR基因沉默后KDR mRNA及蛋白的表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的周期變化。采用四甲基偶氮唑鹽比色法及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗觀察，沉默KDR基因后A549細(xì)胞對多西他賽的敏感性。結(jié)果KDR基因經(jīng)48 h沉默后，A549細(xì)胞的KDR基因和蛋白的表達(dá)出現(xiàn)較明顯的下降(P<0.05)。A549細(xì)胞的周期在G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞數(shù)目減低(P<0.05)。在KDR基因沉默組，A549細(xì)胞對多西他賽的敏感性有明顯的增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論KDR-siRNA能夠明顯沉默A549細(xì)胞KDR基因和蛋白的表達(dá)，并能抑制A549細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其對多西他賽的敏感性。

血管內(nèi)皮生長因子激酶功能區(qū)受體；小干擾RNA；肺癌；A549細(xì)胞；細(xì)胞增殖；多西他賽

在全世界范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率最高，且發(fā)病過程是一個多因素、多步驟的漸進(jìn)過程，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康[1-3]。近些年來，隨著人類基因組計劃的完成和功能基因?qū)W的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與基因的調(diào)控有關(guān)，涉及多種基因復(fù)雜的激活、失活，為臨床提供了新的有效治療腫瘤途徑[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子激酶功能區(qū)受體(kinase-domain insert containing receptor,KDR)基因在肺腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[7-8]。KDR是介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮功能的特異性受體，與惡性腫瘤的增生有關(guān)。本研究將合成的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染入肺癌A549細(xì)胞，分析siRNA對KDR基因沉默的效率；研究沉默KDR基因后，腫瘤細(xì)胞周期的變化及其對多西他賽敏感性的影響,為RNA干擾KDR基因治療肺癌或作為增敏藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細(xì)胞購自南京凱基生物科技有限公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s meuium,DMEM)、無血清Opti-MEM培養(yǎng)基(伊格爾最低限度必需介質(zhì)培養(yǎng)基改良型)、G418培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain rea-ction，RT-PCR)兩步法試劑盒購自大連TaKaRa公司，禽成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄試劑盒由重慶將來試劑公司提供；互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)合成試劑盒購自日本TOYOBO公司；RNA干擾序列購自廣州銳博生物科技有限公司；PCR引物序列為美國Invitrogen公司化學(xué)合成；細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自上海炎彬化工科技有限公司；鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、兔抗人KDR多克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)志的兔抗羊免疫球蛋白G購自美國Invitrogen公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)購自美國Bio-Rad公司；二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀分析蛋白裂解液購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence，ECL)試劑盒購自美國Invitrogen公司；Matrigel凝膠購自美國BD公司；全自動酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA設(shè)計、合成及轉(zhuǎn)染 依據(jù)文獻(xiàn)[9]KDR-siRNA、陰性對照組siRNA SCR(scramble siRNA)序列分別為正義鏈5′-GCCACCAUGUUCUCUAAUATT-3′和反義鏈5′-UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT-3′、正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM中，于37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)，擴(kuò)增傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗。按每孔2×105個將A549細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)融合率達(dá)80%時通過脂質(zhì)體法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時分為3組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1-KDR-siRNA載體為A549/KDR-siRNA組(實(shí)驗組)，轉(zhuǎn)染siRNA載體為A549/control組(對照組)，未轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞為A549組(空白組)。于轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行RNA干擾效應(yīng)的檢測。

1.2.2 半定量RT-PCR檢測 棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌細(xì)胞3次，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增KDR和內(nèi)參GAPDH。KDR正義鏈5′-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA-3′，反義鏈5′-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物795 bp；內(nèi)參照GAPDH正義鏈5′-CGTGGAAGGACT CATGACCA-3′，反義鏈5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為509 bp。PCR反應(yīng)條件為94 ℃變性2 min，按94 ℃變性45 s、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min進(jìn)行反應(yīng)，循環(huán)35次，再于72 ℃延伸8 min。用2%瓊脂糖水平板電泳，經(jīng)100 V電壓電泳45 min。用凝膠自動成像及分析系統(tǒng)，以KDR/GAPDH光密度值(optical density，OD)作為mRNA表達(dá)的相對強(qiáng)度。

1.2.3 Westem Blot檢測 棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，并提取總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，吸取50 μg總蛋白，去離子水補(bǔ)至20 μL，置入等體積2×上樣緩沖液，99 ℃變性10 min。離心，取50 μg蛋白行電泳，電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF上，封閉液中孵育1 h；加入1∶1 000稀釋的KDR一抗4 ℃過夜；0.01 mmol/L TBST(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、150 mmol/L NaCl、8 mmol/L疊氮鈉、0.01%吐溫-20,pH 7.5)洗膜5 min，共3次；加入1∶5 000 HRP標(biāo)志的二抗及GAPDH，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌，并采用ECL法檢測。暗室曝光X線片后，經(jīng)Uvitec公司凝膠成像系統(tǒng)攝像，采用Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的OD，以KDR/GAPDH代表KDR的相對表達(dá)量。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集每組的A549細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整為1×106/L，再經(jīng)PBS沖洗2次后，細(xì)胞沉淀用4 ℃的70%冷乙醇混勻后備用，洗滌細(xì)胞，后再用PBS調(diào)整細(xì)胞為1×106/L與含50 μg/mL RNA酶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。100 μg/mL碘化丙啶進(jìn)行細(xì)胞的DNA染色，在暗室中置1 h后經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測得A549細(xì)胞的DNA含量分布，并且計算出每個周期細(xì)胞的百分率。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽比色法檢測沉默KDR后A549細(xì)胞對多西他賽的敏感性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染KDR-siRNA 48 h以后，收集各組的A549細(xì)胞，并將其接種到96孔板中，每個樣本設(shè)立3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別加入多西他賽(6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)培養(yǎng)48 h后，每孔加入四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)]20 μL(質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，放置于孵箱內(nèi)4 h后棄掉上清液后再將其加入到10%的十二烷基磺酸鈉200 μL中過夜。將其震蕩15 min，用全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處的OD(OD570)。抑制率(%)=[(OD570對照組-OD570實(shí)驗組)/(OD570對照組-OD570空白組)]×100%。

1.2.6 平板克隆檢測沉默KDR后的A549細(xì)胞對多西他賽的敏感性 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染KDR-siRNA 48 h后，將各組A549細(xì)胞進(jìn)行收集，并接種置6孔板，每個樣本設(shè)立3個復(fù)孔，等細(xì)胞出現(xiàn)貼壁后，將其分別加入多西他賽(6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，棄掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，經(jīng)95%乙醇固定10 min后，再經(jīng)吉姆薩染液染色10 min后沖洗、晾干，根據(jù)下面的公式，用Quantity One軟件計算克隆形成的抑制率?？寺⌒纬梢种坡?%)=[1-(實(shí)驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))]×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件，計量資料組間比較行單因素方差分析，2組間的連續(xù)變量比較采用t檢驗，多組間的連續(xù)變量比較采用方差分析方法、協(xié)方差校正，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KDR-siRNA抑制KDR mRNA的表達(dá) KDR mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測與對照組、空白組比較，實(shí)驗組條帶明顯變窄，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.2 siRNA抑制KDR蛋白的表達(dá) KDR蛋白表達(dá)的Western Blot檢測與對照組、空白組比較，實(shí)驗組條帶顯著變窄，其OD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

圖1 RT-PCR檢測A549細(xì)胞中KDR mRNA的表達(dá)

圖2 Western Blot檢測A549細(xì)胞中KDR蛋白的表達(dá)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 經(jīng)流式細(xì)胞儀分析A549細(xì)胞的周期，結(jié)果顯示實(shí)驗組在G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞數(shù)目減低，實(shí)驗組與對照組、空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞沒有顯著的變化(P>0.05)，見表1。

表1 siRNA抑制KDR表達(dá)對A549細(xì)胞周期的影響

注：與空白組、對照組比較，*P<0.05

2.4 干擾KDR后A549細(xì)胞對多西他賽的敏感性

經(jīng)MTT法檢測轉(zhuǎn)染pGenesil-1-KDR-siRNA后，A549細(xì)胞對不同濃度的多西他賽敏感性均提高。隨著藥物濃度的增強(qiáng)，多西他賽對A549細(xì)胞的抑制率也有增加，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，實(shí)驗組A549細(xì)胞對不同濃度的多西他賽敏感性明顯高于空白組和對照組(P<0.05，表2)。

2.5 對A549細(xì)胞集落形成的影響 經(jīng)平板克隆檢測顯示，pGenesil-1-KDR-siRNA轉(zhuǎn)染后，A549細(xì)胞對不同濃度的多西他賽敏感性均有提高，細(xì)胞克隆形成數(shù)出現(xiàn)顯著的減少，克隆形成抑制率也顯著提高(P<0.05)。隨著多西他賽藥物濃度的增強(qiáng)，其對細(xì)胞克隆形成的抑制率也有增加，并且顯示出劑量依賴性，實(shí)驗組A559細(xì)胞對不同濃度的多西他賽克隆形成抑制率明顯高于空白組和對照組(P<0.05，表2)。

表2 多西他賽對A549細(xì)胞增殖及A549細(xì)胞克隆形成抑制率

注：與空白組、對照組比較，*P<0.05

3 討論

隨著肺癌發(fā)病率的逐年上升、發(fā)病年齡的逐漸年輕化，人類健康受到了嚴(yán)重的威脅[10-12]。有研究認(rèn)為，腫瘤發(fā)病主要原因是細(xì)胞增殖過度及細(xì)胞凋亡受抑制、死亡不足，致使病變組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞存活時間延長，細(xì)胞群體內(nèi)存活與死亡的平衡遭到了破壞，出現(xiàn)存活大于死亡、腫瘤細(xì)胞數(shù)目的凈增長加大的不平衡現(xiàn)象[13]，據(jù)此想辦法阻止腫瘤細(xì)胞的增殖就成為了新的一種治療方向。近些年來，隨著人類基因組計劃的完成和功能基因科學(xué)的快速發(fā)展，腫瘤基因方面的治療得到醫(yī)學(xué)界廣泛的重視。肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移中涉及眾多基因結(jié)構(gòu)和功能異常，明確關(guān)鍵基因?qū)Ψ伟┌l(fā)病中起的作用,對臨床診斷、治療及預(yù)防肺癌意義重大。

RNA干擾技術(shù)的快速發(fā)展，為腫瘤基因的治療提供了基礎(chǔ)，近年來已成為研究熱點(diǎn)[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，KDR在細(xì)胞生長和分化中起著關(guān)鍵的作用，因為KDR可以自分泌形式直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。本實(shí)驗基于腫瘤與正常組織中KDR的表達(dá)所具有的差異特點(diǎn)，設(shè)計并合成KDR-siRNA序列，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。實(shí)驗結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后實(shí)驗組顯示出較明顯的生長抑制,48 h后呈現(xiàn)明顯的抑制作用。

本實(shí)驗通過小分子KDR干擾RNA采用流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞周期，結(jié)果顯示阻滯在G0/G1期，S期的細(xì)胞數(shù)目減低，并且有腫瘤生長停滯的現(xiàn)象；多西他賽對沉默KDR后A549細(xì)胞的敏感性有顯著增強(qiáng)作用，表明KDR被沉默后細(xì)胞的分裂增殖可有效降低，并使肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性增強(qiáng)。本實(shí)驗研究結(jié)果表明，小分子KDR干擾RNA沉默KDR基因可有效抑制細(xì)胞增殖，并能增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞對化療藥物的敏感性，這可為惡性腫瘤的治療或輔助治療提供新的思路和研究方向。

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Kinase-domain insert containing receptor gene silencing inhibited proliferation of human lung cancer cell line A549 and enhanced their sensitivity to docetaxel

ZHANGXiuyi

(Department of Respiratory, Chengde Central Hospital, Chengde Hebei 067000, China)

Objective This study investigated the effect of small interfering RNA-mediated kinase-domain insert containing receptor (KDR) knock-down on proliferation of human lung cancer cell line A549 and their sensitivity to docetaxel. Methods The small interfering RNA (siRNA) against KDR was constructed and transfected into A549 cells with LipofectamineTM2000. The expre-ssion of KDR was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and Western Blot. Flow cytometry was used to detect the cell cycle. Sensitivity to docetaxel after transfection were exa-mined by methyl thiazolyl tetrazolium assay and clonogenic assay. Results In A549 cells， the protein and mRNA levels of KDR were decreased significantly after transfection，and reduction of proli-feration was related to an increase in the fraction of G0/G1 phase. The sensitivity of A549 cells to docetaxel was increased significantly after transfection. Conclusion The KDR special siRNA silenced KDR，decreased A549 cells proliferation and enhanced their sensitivity to docetaxel.

Kinase-domain insert containing receptor (KDR); Small interfering RNA (siRNA); Lung cancer; A549 cells; Cell proliferation; Docetaxel

067000 河北 承德，承德市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(張秀義)

R734.2；R979.1

A

2095-3097(2015)03-0133-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.03.002

2014-12-01 本文編輯：徐海琴)