2014年豬群常見細(xì)菌性疫病的分離鑒定與流行病學(xué)調(diào)查

郭　龍　湯細(xì)彪　劉　田　董　超　劉　峰　喻紅艷　吳　斌

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心，武漢430070

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2014年豬群常見細(xì)菌性疫病的分離鑒定與流行病學(xué)調(diào)查

郭龍湯細(xì)彪劉田董超劉峰喻紅艷吳斌

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心，武漢430070

摘要2014年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心對(duì)湖北、湖南、河南、廣東、浙江等21個(gè)省市送檢的12 452份臨床病料進(jìn)行細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)和PCR方法鑒定，共分離出3 926株致病菌，并對(duì)其中所分離到的225株副豬嗜血桿菌和231株鏈球菌采用玻片凝集方法進(jìn)行血清型分型。結(jié)果表明鏈球菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、波氏桿菌、致病性大腸桿菌和豬丹毒絲菌等9種病原菌已嚴(yán)重影響我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的健康生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞豬；細(xì)菌；血清型；分離鑒定；流行病學(xué)

郭龍，男，碩士，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心細(xì)菌室主任。

1　材料與方法

1.1病料及來源

病料采集于湖北、湖南、河南、廣東、浙江、安徽、江西、河北、福建、山東、上海等21個(gè)省市的發(fā)病豬場(chǎng)，分離組織主要包括出現(xiàn)病理變化的肺、氣管、腦、關(guān)節(jié)、脾臟以及淋巴結(jié)等。

1.2主要材料及儀器

胰蛋白大豆肉湯（TSB）和胰蛋白大豆瓊脂（TSA）購自美國(guó)Becton Dickinsonand Company公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD，又稱V因子）購自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；犢牛血清購自杭州四季青公司；麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基和生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑公司，CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Forma公司；生物顯微鏡購自Nikon公司，鏈球菌和副豬嗜血桿菌分型所用標(biāo)準(zhǔn)血清為本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.3細(xì)菌初步分離

在超凈工作臺(tái)中，對(duì)各臟器表面進(jìn)行消毒，嚴(yán)格無菌操作取各臟器深層一小塊組織，將所取組織均勻涂抹于含犢牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基一角，分區(qū)劃線，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24～48 h。

1.4細(xì)菌的純化鑒定

在培養(yǎng)好的原代TSA平皿中用無菌的接種環(huán)挑取菌落少許，作抹片、革蘭氏染色、鏡檢。若其染色和細(xì)菌形態(tài)與懷疑的致病菌一致，可挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，所得培養(yǎng)物為純培養(yǎng)菌株。純培養(yǎng)物的目的在于對(duì)分離的病原菌進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定和其他試驗(yàn)。

1）鏈球菌的鑒定。

形態(tài)特征：為革蘭氏陽性菌，在臟器圖片標(biāo)本中呈單個(gè)或成對(duì)卵圓形，菌落小，灰白，透明，液體培養(yǎng)染色呈短鏈狀排列。

培養(yǎng)特性：普通瓊脂培養(yǎng)平板上37℃培養(yǎng)24 h后長(zhǎng)成灰白色透明的小菌落，多呈β型溶血。

2）副豬嗜血桿菌的鑒定。

形態(tài)特性：革蘭氏陰性桿狀菌，具有多形性，從球桿狀到纖細(xì)狀。

培養(yǎng)特性：本菌在巧克力瓊脂上培養(yǎng)48～72 h依然生長(zhǎng)很差，菌落為光滑型，灰白色透明，不溶血，本菌生長(zhǎng)嚴(yán)格需要V因子，不需要X因子。如果與金黃色葡萄球菌同時(shí)劃線37℃培養(yǎng)24～48 h后，有典型的“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”，并且副豬嗜血桿菌菌落周圍不溶血。

生化特性：氧化酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽性，尿素酶試驗(yàn)陰性，不長(zhǎng)生靛基質(zhì)，不溶血，CAMP試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麥芽糖等碳水化合物。

3）巴氏桿菌的鑒定。

形態(tài)特性：革蘭氏染色呈紅色的細(xì)小球桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染。

培養(yǎng)特性：血液瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，24 h長(zhǎng)成淡灰色、露珠樣小菌落，表面光滑閃亮，邊緣整齊，不溶血。在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。

生化特性：不形成靛基質(zhì)，不液化明膠，產(chǎn)生硫化氫和氨，MR、VP陰性。

4）波氏桿菌的鑒定。

形態(tài)特性：革蘭氏陰性、兩極著色、散在或成對(duì)排列、呈細(xì)小球桿狀菌。

培養(yǎng)特性：血液瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，48 h長(zhǎng)成淡灰色、露珠樣小菌落，表面光滑閃亮，邊緣整齊，不溶血。在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。乳黃色、表面光滑、邊緣整齊、中心隆起、黏稠、扁平。

生化特性：尿素酶試驗(yàn)陽性、能利用檸檬酸鹽、還原硝酸鹽、不產(chǎn)生靛基質(zhì)、不產(chǎn)生硫化氫、MR和VP試驗(yàn)均為陰性、不液化明膠，不氧化也不發(fā)酵包括葡萄糖在內(nèi)的所有糖。

5）大腸桿菌的鑒定。

形態(tài)特征：革蘭氏陰性短桿菌，周身鞭毛，在組織和滲出液圖片染色標(biāo)本中常呈兩級(jí)著色（比巴氏桿菌大），要注意同巴氏桿菌區(qū)別。

培養(yǎng)特性：普通瓊脂平皿上37℃培養(yǎng)24 h后，長(zhǎng)成圓形、微隆起、濕潤(rùn)、半透明無色菌落。一些致病菌株在綿羊血平板上呈β型溶血。在麥康凱瓊脂上長(zhǎng)成紅色菌落。

6）豬丹毒絲菌的鑒定。

形態(tài)特征：革蘭氏染色鏡檢后可見革蘭氏陽性兩端鈍圓或彎曲的細(xì)小桿菌，易形成長(zhǎng)絲狀。

培養(yǎng)特性：分離的細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基上細(xì)菌菌落為圓形、透明、灰白色，針尖大小、光滑、濕潤(rùn)、露珠樣的小菌落，培養(yǎng)基中加入血清、葡萄糖、蛋白水解物或表面活性劑吐溫- 80，可促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。

1.5分型方法

本實(shí)驗(yàn)室利用副豬嗜血桿菌血清1～15型標(biāo)準(zhǔn)菌株成功地制備出15種血清型高免血清（副豬嗜血桿菌15個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)株由澳大利亞昆士蘭動(dòng)物研究中心饋贈(zèng)），鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)血清采用標(biāo)準(zhǔn)株抗原靜脈注射家兔制備。將從臨床分離鑒定出的副豬嗜血桿菌和鏈球菌純化擴(kuò)大培養(yǎng)，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，保證菌量為30億/mL，取約3 mL副豬嗜血桿菌菌液裝入青霉素瓶放入高壓蒸氣滅菌鍋爐121℃，高溫處理30 min后放于離心機(jī)7 000 r/min離心2 min，所得上清液即為待檢抗原，待定型鏈球菌只需用無菌生理鹽水將菌苔洗下，無需高溫處理和離心。取載玻片1張，用移液器分別吸取血清及抗原10 μL，用牙簽將血清和抗原充分混勻，輕輕搖動(dòng)玻片1～2 min，在診斷血清中，如混懸液由混濁變澄清并出現(xiàn)肉眼可見的凝集絮狀物為陽性結(jié)果；如與對(duì)照相同，則為陰性結(jié)果。

2　結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1分離細(xì)菌統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2014年全國(guó)各地所送檢的12 452份臨床樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，各省病原菌的分離情況見表1，從送檢病料中共分離到致病菌3 926株，其中鏈球菌1 469株占所分離細(xì)菌總數(shù)37.42%，副豬嗜血桿菌883株占22.49%，巴氏桿菌556株占14.16%，波氏桿菌153株占3.9%，沙門菌227株占5.78%，大腸桿菌367株桿菌占9.35%，豬丹毒絲菌94株占2.39%，葡萄球菌155株占3.95%，豬傳染性胸膜肺炎23株占0.59%。

2.2部分細(xì)菌血清分型統(tǒng)計(jì)

1）副豬嗜血桿菌血清分型。

對(duì)2014年部分省份所分離到的副豬嗜血桿菌隨機(jī)選取225株進(jìn)行了血清型分型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：我國(guó)副豬嗜血桿菌主要流行血清型為4型（占32.89%）、5型（25.33%）、13型（13.78%）。

2）鏈球菌血清分型。

2014年本實(shí)驗(yàn)室對(duì)部分省份分離到的231株鏈球菌進(jìn)行血清型定型，其中1型（7株）占總體比例為3.03%；2型（103株）為44.59%；3型（5株）為2.16%；5型（5株）為2.16%；7型（39株）為16.88%；9型（35）株為15.15%；未定出型（37株）為16.02%。其中，未定出型的37株鏈球菌有2種可能：一是該鏈球菌為非豬源鏈球菌，二是該鏈球菌的血清型不屬于這6種。

3　分析與討論

2014年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心共針對(duì)全國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)所送檢的12 452份樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，共分離到3 926株致病菌，其中鏈球菌（1 469株）和副豬嗜血桿菌（883株）占分離總數(shù)的59.91%，豬鏈球菌有35個(gè)血清型，副豬嗜血桿菌現(xiàn)已知有15個(gè)血清型以上，其血清型間的交叉免疫原性差，并且具有地方流行性，而當(dāng)前我國(guó)副豬嗜血桿菌主要流行血清型為4型、5型，豬鏈球菌以2型、7型為主。因此有必要經(jīng)常對(duì)本場(chǎng)豬群抗體定期監(jiān)測(cè)和評(píng)估，并盡可能選擇與本場(chǎng)主要流行血清型相符合廠家的疫苗進(jìn)行合理免疫，以增強(qiáng)保護(hù)力。伴隨我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)集約化程度越來越高，細(xì)菌性疾病的發(fā)生趨勢(shì)逐漸復(fù)雜，以前危害較大的一些疾病如豬丹毒已不再是規(guī)模化豬場(chǎng)主要防疫重點(diǎn)，而近2年很多地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)岀現(xiàn)中大豬和種豬群突然高燒（可達(dá)41℃甚至以上）喘氣、突然發(fā)病且病程極短、死亡前口吐血沫、嘔吐以及神經(jīng)癥狀，部分皮膚上岀現(xiàn)棱形不規(guī)則斑塊，死亡后發(fā)紫敗血，解剖主要以肺臟水腫、岀血、氣管內(nèi)有大量泡沫、腎臟高度岀血腫大，且該情況多以散發(fā)和以中大豬為主。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)病原學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)：其主要致病菌是豬丹毒，并伴隨豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒2型、豬鏈球菌病及豬傳染性胸膜肺炎等混合感染問題，其一般發(fā)病較急且中大豬損失較慘重。希望規(guī)模化豬場(chǎng)能高度重視。

表1　 2014年細(xì)菌分離統(tǒng)計(jì)株

細(xì)菌性疾病目前最好是通過日常必要藥物保健和疫苗免疫來進(jìn)行預(yù)防。同時(shí)加強(qiáng)對(duì)飼料來源污染的生物因子的監(jiān)測(cè)力度，摸清豬場(chǎng)多重感染的原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染疾病的種類，建立豬場(chǎng)完善、合理的監(jiān)測(cè)方案，實(shí)施種豬場(chǎng)疾病凈化，建立健康的種豬群。一旦臨床癥狀已經(jīng)出現(xiàn)，應(yīng)合理采用敏感藥物進(jìn)行治療，發(fā)病期間應(yīng)對(duì)整個(gè)豬群進(jìn)行藥物預(yù)防，而不僅僅只是對(duì)那些表現(xiàn)出癥狀的豬用藥，抗生素預(yù)防或口服藥物治療對(duì)嚴(yán)重的細(xì)菌病毒多重感染可能無效，同時(shí)治療費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高且易產(chǎn)生耐藥性。因此有條件的豬場(chǎng)可以考慮定期通過實(shí)驗(yàn)室從典型發(fā)病豬中分離具有代表性致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，且選擇敏感藥物合理使用，從而減少損失。

收稿日期：2015- 08- 30