四氯化碳構(gòu)建慢性肝損傷兔膽石癥模型

唐乾利，王兵，呂震,3，李輝,3，金萌,3，王宇，王澍，俞淵，黃欣

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000 E-mail：htmgx@163.com；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

四氯化碳構(gòu)建慢性肝損傷兔膽石癥模型

唐乾利1，王兵2，呂震1,3，李輝1,3，金萌1,3，王宇1，王澍1，俞淵2，黃欣2

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000 E-mail：htmgx@163.com；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

目的 研究四氯化碳構(gòu)建慢性肝損傷兔膽石癥模型的可行性。方法 將50只新西蘭大白兔分為正常組10只、肝纖維化膽石癥組20只、肝硬化膽石癥組20只，其中肝纖維化膽石癥組予20%的CCl4-橄欖油溶液0.2 ml/kg腹腔注射，肝硬化膽石癥組予25%的CCl4-橄欖油溶液0.3 ml/kg腹腔注射，每隔3天一次，連續(xù)用藥12周，同時(shí)投以高膽固醇、高熱量致石飼料，正常組正常飲食。根據(jù)造模結(jié)果評(píng)判CCl4構(gòu)建模型的可行性、安全性、重復(fù)性以及觀察動(dòng)物死亡率。結(jié)果 正常組未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，肝纖維化膽石癥組、肝硬化膽石癥組死亡率分別是20%、25%，兩組動(dòng)物模型成石率均為70%，兩組的死亡率、成石率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病理檢測、Masson染色提示肝纖維組織明顯增多或假小葉形成，伴隨著假小葉內(nèi)中央靜脈缺如，部分肝臟組織壞死。結(jié)論 四氯化碳聯(lián)合高熱量、高膽固醇致石飼料進(jìn)行慢性肝損傷兔膽石癥模型的構(gòu)建，具有安全可行、成功率高、死亡率低、操作方便等優(yōu)勢(shì)，為膽石癥相關(guān)研究提供了良好的動(dòng)物模型。

CCl4；藥物性肝損傷，慢性；兔膽石癥；致石飼料

利用動(dòng)物模型進(jìn)行肝損傷研究，已被證明是一種有效的研究方法，但大都是大鼠肝損傷模型，而對(duì)兔肝損傷模型的研究相對(duì)較少。因大鼠的解剖特點(diǎn)缺少膽囊，無法進(jìn)行膽囊結(jié)石的研究，而兔可以在肝損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行膽結(jié)石的研究且適合建立肝組織病變、膽汁動(dòng)態(tài)研究動(dòng)物模型。四氯化碳(CCl4)又稱四氯甲烷，大量研究資料顯示，四氯化碳是能夠引起人類嚴(yán)重急性肝損害的劇毒類化學(xué)藥物。許多動(dòng)物研究證明，四氯化碳除可以導(dǎo)致急性肝損傷外，多次反復(fù)的刺激可致使慢性肝損傷的發(fā)生，而慢性肝損傷主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞的再生和纖維化。隨著染毒時(shí)間和次數(shù)的增加，肝臟壞死程度逐漸加重可致肝硬化的發(fā)生。我們參考金博[1]設(shè)計(jì)的模型制備方法，用四氯化碳對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行腹腔注射，同時(shí)投以高膽固醇、高熱量致石飼料，建立慢性肝損傷兔膽石癥模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性4月齡新西蘭大白兔50只，體重約2.5 kg左右(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK桂2011-0010)。每籠飼養(yǎng)新西蘭大白兔2只，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度保持在20～24℃，濕度維持在42%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 ①四氯化碳(由天津市進(jìn)豐化工有限公司生產(chǎn))；②橄欖油(由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)：20130513)；③水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2014031102)；④膽固醇(由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H31021290)；⑤膽酸(購自德國sigma公司，code:101335972)；⑥Masson 三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：1310168003)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 病理圖文分析系統(tǒng)(HPIAS-1000P)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)、輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)(HM315)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及造模方法 將50只新西蘭大白兔分為正常組10只，肝纖維化膽石癥組和肝硬化膽石癥組各20只，各組間性別比較經(jīng)Ridit分析、體重比較經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間可比性良好。其中肝纖維化膽石癥組大白兔予20%的CCl4-橄欖油溶液0.2ml/kg腹腔注射，肝硬化膽石癥組大白兔予25%的CCl4-橄欖油溶液0.3ml/kg腹腔注射，每隔3天一次，連續(xù)用藥12周，同時(shí)對(duì)肝纖維化膽石癥組、肝硬化膽石癥組投以高膽固醇、高熱量致石飼料(普通飼料加入1.2%膽固醇、0.1%膽酸、5%蔗糖及3.5%魚肝油，適量雞蛋)，正常組正常飲食。造模過程中死亡的新西蘭大白兔立即取肝臟組織待行病理學(xué)檢測。

1.5 肝組織標(biāo)本采集 造模12周后，根據(jù)病理診斷結(jié)果，將各組新西蘭大白兔用10%水合氯醛麻醉后，取相同部位肝組織，切取大小為10mm×5mm×5mm的肝臟組織，將切取的肝組織投入10%的福爾馬林固定液，固定至少24～48h后送檢，行病理檢測和Masson染色檢查。

1.6 各組死亡率、成石率比較 注射CCl4-橄欖油溶液12周后，統(tǒng)計(jì)各組新西蘭大白兔的死亡率、成石率。計(jì)算公式為：死亡率=(原始例數(shù)-剩余例數(shù))/原始例數(shù)×100%，成石率=成石例數(shù)/原始例數(shù)×100%。

1.7 模型構(gòu)建成功標(biāo)準(zhǔn)[2]

1.7.1 肝纖維化膽石癥組模型成功標(biāo)準(zhǔn) 肝小葉匯管區(qū)及其周圍纖維化較為明顯，纖維間隔逐漸形成，但小葉結(jié)構(gòu)仍保留；或肝小葉纖維間隔明顯伴結(jié)構(gòu)紊亂，未出現(xiàn)肝硬化；解剖發(fā)現(xiàn)膽囊內(nèi)有泥沙樣結(jié)石，程度不同。

1.7.2 肝硬化膽石癥組模型成功標(biāo)準(zhǔn) 假小葉形成并增多，早期肝硬化；或見假小葉形成，小葉內(nèi)中央靜脈缺如，細(xì)胞排列紊亂，多數(shù)細(xì)胞水腫，局部氣球樣變，小膽管增生、伴有膽汁淤積；解剖后發(fā)現(xiàn)膽囊內(nèi)有不規(guī)則或球狀結(jié)石，數(shù)量較多，量不等。

1.8 倫理學(xué)處理 根據(jù)課題研究的目的、內(nèi)容和要求，總課題組已經(jīng)通過動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的審批。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性肝損傷膽石癥模型的建立 連續(xù)腹腔注射CCl4-橄欖油溶液12周后，肝纖維化膽石癥組新西蘭大白兔精神稍差，運(yùn)動(dòng)減少，毛發(fā)粗糙，食欲減退，身體逐漸消瘦。對(duì)造模過程中死亡動(dòng)物及最終處死解剖后肉眼觀肝臟表面色澤稍暗，質(zhì)地稍硬，出現(xiàn)不同程度肝損傷，膽囊內(nèi)有少量泥沙樣結(jié)石或不規(guī)則顆粒狀結(jié)石形成，結(jié)石體積較小(一般<0.2cm)。肝硬化膽石癥組新西蘭大白兔精神差，呈嗜睡狀態(tài)，毛發(fā)粗糙更甚，食欲明顯減退，身體消瘦更為明顯。解剖后觀察，肝損傷嚴(yán)重，肝臟表面色澤較暗，質(zhì)地稍硬，膽囊內(nèi)見有不規(guī)則顆粒狀結(jié)石形成，部分呈球狀，體積較大(一般>0.2cm)。正常組新西蘭大白兔精神狀態(tài)、一般情況及解剖肝臟均未見明顯變化。具體見以下圖1～圖6。

圖1 正常組大白兔肝臟

圖2 肝纖維膽石癥組大白兔肝臟

圖3 肝硬化膽石癥組大白兔肝臟

圖4 正常組大白兔膽囊

圖5 肝纖維化膽石癥組泥沙樣結(jié)石

圖6 肝硬化膽石病組膽囊結(jié)石

2.2 各組死亡率、成石率的比較 正常組未見死亡、未見結(jié)石形成，死亡率和成石形成率均為0%；肝纖維化膽石癥組死亡4只、成石14只，死亡率、成石率分別是20%、70%；肝硬化膽石癥組死亡5只、成石14只，死亡率、成石率分別是25%、70%；三組死亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.656，P<0.001)，三組成石率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.717，P<0.001)，肝硬化膽石癥組死亡率、成石率與肝纖維化膽石癥組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組死亡率、成石率統(tǒng)計(jì)表

2.3Masson染色及病理檢測結(jié)果 病理采用HE染色后光鏡下可見肝纖維化膽石癥組、肝硬化膽石癥組大白兔肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞排列紊亂，肝血竇間隙增大，部分肝細(xì)胞腫大并出現(xiàn)氣球樣變，炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增多，局部見假小葉形成，表明肝損傷模型造模成功。部分模型組的新西蘭大白兔肝臟區(qū)域呈現(xiàn)點(diǎn)狀、片狀壞死，少許形成橋接壞死(見圖7、圖8)。正常組未見明顯病理變化，其余兩組新西蘭大白兔都存在不同程度肝損傷。Masson染色發(fā)現(xiàn)肝纖維化膽石癥組、肝硬化膽石癥組大白兔不同程度地出現(xiàn)肝臟纖維組織明顯增多并呈現(xiàn)藍(lán)色樣改變，肝小葉匯管區(qū)表現(xiàn)尤為明顯，肝硬化膽石癥組大白兔個(gè)別可見到假小葉形成，對(duì)模型的構(gòu)建成功具有重要的提示意義(見圖9、圖10)。

圖7 肝纖維化膽石癥組纖維組織增生(100×)

圖8 肝硬化膽石癥組假小葉形成(100×)

HE染色

圖9 肝纖維化膽石癥組纖維增多(100×)

圖10 肝硬化膽石癥組假小葉形成(100×)

Masson染色

3 討論

通過本次實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)注射CCl4-橄欖油溶液后，新西蘭大白兔的精神逐漸變差，運(yùn)動(dòng)明顯減少，毛發(fā)粗糙泛黃，食欲減退，身體逐漸消瘦，隨用藥劑量的逐步增加該現(xiàn)象越明顯；對(duì)造模過程中死亡及最終處死的新西蘭大白兔進(jìn)行解剖，探明肝纖維化膽石癥組、肝硬化膽石癥組大白兔均出現(xiàn)不同程度的肝損傷，肝臟表面色澤較暗，質(zhì)地逐漸變硬，肝硬化膽石癥組肝臟損害表現(xiàn)尤為明顯；Masson染色和病理檢測發(fā)現(xiàn)鏡下可見肝纖維化膽石癥組、肝硬化膽石癥組新西蘭大白兔肝臟纖維組織明顯增多，肝細(xì)胞排列紊亂，部分出現(xiàn)脂肪變性、氣球樣變，甚或壞死，這些情況在肝小葉匯管區(qū)表現(xiàn)較為突出，肝硬化膽石癥組可見到假小葉形成，證明慢性肝損傷兔膽石癥模型的構(gòu)建成功。

四氯化碳(CCl4) 是最常用的化學(xué)性肝損傷模型誘導(dǎo)劑，誘發(fā)的肝損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是一種經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷模型，其所致的肝損傷一般分急、慢性兩種。四氯化碳引起的肝損傷的主要表現(xiàn)是血清中轉(zhuǎn)氨酶活性增加，肝細(xì)胞脂質(zhì)出現(xiàn)過氧化或者壞死[3-4]。四氯化碳進(jìn)入機(jī)體后，被肝微粒體細(xì)胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(CCl3+)，促使細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜脂質(zhì)過氧化，致使細(xì)胞因子和氧自由基釋放，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及高爾基體甚至細(xì)胞膜的變性和壞死，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成與能量代謝的障礙[5]；同時(shí)，激活枯否細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，進(jìn)而影響肝細(xì)胞的DNA合成與分裂，引起肝損傷[6-7]。一系列的動(dòng)物研究證明，四氯化碳除致急性肝損傷外，反復(fù)多次的刺激可導(dǎo)致慢性肝損傷的發(fā)生，而慢性肝損傷的主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞再生和纖維化[8]。隨著染毒時(shí)間和次數(shù)的增加，肝臟壞死程度逐漸加重可致肝硬化的發(fā)生。

許多研究表明：肝損傷與膽結(jié)石形成緊密相關(guān)，肝臟不僅僅是唯一產(chǎn)生正常膽汁的器官，同時(shí)也是產(chǎn)生致石性膽汁的場所[9-10]。肝細(xì)胞功能是否正常，對(duì)膽結(jié)石的形成具有相當(dāng)重要的影響。膽結(jié)石的形成機(jī)制主要與膽汁中主要成分的改變密切相關(guān)，如非結(jié)合性膽紅素增多，血清中膽汁酸合成減少等，肝細(xì)胞所分泌的各種膽汁酸成分的比例在正常生理狀態(tài)下始終維持在一個(gè)相對(duì)恒定的范圍內(nèi)[11-12]。肝細(xì)胞受損，引起膽汁代謝成分的改變、分泌致石性膽汁主要是由于各種致石性因素在肝臟的綜合作用所導(dǎo)致[13]。在壞死性組織、糖蛋白及自由基等促成核因子的作用下或在膽道梗阻、膽汁淤積的環(huán)境中能加快致石性膽汁結(jié)晶析出，然后經(jīng)過較為復(fù)雜的理化反應(yīng)最終形成結(jié)石[14]。由于肝臟與膽囊的解剖關(guān)系密切，功能相互協(xié)調(diào)，在病理狀態(tài)下兩者亦互相影響或互為因果，而膽結(jié)石的逐漸形成同樣會(huì)對(duì)肝臟、肝細(xì)胞產(chǎn)生損害，彼此之間相互作用的結(jié)果所形成的惡性循環(huán)可能是致使膽結(jié)石難以根治的原因之一[9]。

四氯化碳對(duì)肝臟有明顯的損害作用，促使肝細(xì)胞分泌膽汁成分改變，產(chǎn)生致石性膽汁，進(jìn)而經(jīng)過復(fù)雜變化最終形成結(jié)石。高熱量、高膽固醇致石飼料促進(jìn)膽固醇結(jié)石的形成，膽囊結(jié)石的病變可引起感染及梗阻，使肝內(nèi)膽管壓力升高瘀膽，肝細(xì)胞損害不同程度加重，病情復(fù)雜化。二者相互影響、互相作用，對(duì)兔慢性肝損傷膽石癥模型的構(gòu)建具有安全可行、成功率高、死亡率低、簡單易行、操作方便等優(yōu)勢(shì)，為慢性肝損傷膽石癥動(dòng)物模型的構(gòu)建奠定理論基礎(chǔ)，以期對(duì)相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究提供一定的借鑒和指導(dǎo)作用。

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Carbon tetrachloride in developing cholelithiasis rabbit model of chronic liver injury

Tang Qianli1, Wang Bing2，Lü Zhen1,3，Li Hui1,3，Jin Meng1,3，Wang Yu1，Wang Shu1，Yu Yuan2，Huang Xin2

(1.YoujiangMedicalUniversityforNationalities/WesternGuangxiKeyLaboraroryforHighIncidentDiseaseControlandPrevention,Baise533000,Guangxi,ChinaE-mail:htmgx@163.com;2.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi,China;3.GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,Guangxi,China)

Objective To study the feasibility of carbon tetrachloride (CCl4) for developing rabbit cholelithiasis model of chronic liver injury. Methods Fifty New Zealand white rabbits were randomly divided into 3 groups: a blank control group (10 rabbits), a liver fibrosis cholelithiasis group (20 rabbits) and a cirrhosis cholelithiasis group (20 rabbits). Among these groups, the rabbits of the liver fibrosis cholelithiasis group received 20% CCl4-olive oil solution (0.2 ml/kg) by intraperitoneal injection, and the liver cirrhosis cholelithiasis group received 25% CCl4-olive oil solution (0.3 ml/kg) by intraperitoneal injection, once every 3 days for 12 weeks; at the same time the rabbits of the liver fibrosis cholelithiasis group and the liver cirrhosis cholelithiasis group were fed high cholesterol and high calorie lithogenic diet. The rabbits in the blank control group were given normal diet. Then according to the model building results, an evaluation of the feasibility, the safety, the repeatability of CCl4for building the rabbits models, and observed the animal death rate. Results No rabbits died in the blank control group, the animal death rates of the liver fibrosis cholelithiasis group and the cirrhosis cholelithiasis group were 20% and 25%, respectively, and both the stone formation rate of the two groups was 70%. HE staining and Masson staining results mainly presented that liver fibrous tissues increased significantly or false flocculus was formed, and the false flocculus central vein was absent, part of the liver tissues was necrosis. Conclusion The use of CCl4combined with high cholesterol and high calorie lithogenic diet can build a cholelithiasis model in rabbits with chronic liver injury, which has the advantages of safety, feasibility, high successful rate, low death rate and easy performance, and will provide fair animal models for cholelithiasis study.

carbon tetrachloride; drug-induced liver injury, chronic; rabbit cholelithiasis; lithogenic diet

2014年國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81470198)及2014年廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：桂科能14123006-3)

R

A

1001-5817(2015)06-0765-04

10.3969/j.issn.1001-5817.2015.06.001

2015-12-01