靈芝實(shí)體提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性炎癥的鎮(zhèn)痛抗炎作用的觀察①

楊文寶，黃秋菊，梁彩梅，劉海燕，趙善民

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)2012級(jí)本科，廣西 百色 E-mail：635957824@qq.com；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

靈芝實(shí)體提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性炎癥的鎮(zhèn)痛抗炎作用的觀察①

楊文寶1，黃秋菊1，梁彩梅1，劉海燕1，趙善民2②

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)2012級(jí)本科，廣西 百色 E-mail：635957824@qq.com；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

目的 觀察靈芝實(shí)體水、醇提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)性炎癥的鎮(zhèn)痛抗炎作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法 制備靈芝實(shí)體的水提取物和75%乙醇提取物進(jìn)行鎮(zhèn)痛抗炎實(shí)驗(yàn)觀察，采用醋酸扭體法和熱板法進(jìn)行鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 靈芝實(shí)體水、醇提取物具有明顯的抑制小鼠扭體的作用(P<0.01)；靈芝提取物在給藥后1h、2h均能明顯提高熱板法小鼠的痛閾值(P<0.05或P<0.01)；但水提取物較醇提取物作用明顯。靈芝水、醇提取物均能抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹(P<0.05或P<0.01)，但醇提取物較水提取物作用明顯。 結(jié)論 靈芝實(shí)體水、醇提取物對(duì)炎癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

靈芝實(shí)體；提取液；鎮(zhèn)痛；抗炎；小鼠

靈芝是擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱多孔菌科屬藥用真菌，作為傳統(tǒng)中藥已有2000多年的歷史，祖國醫(yī)學(xué)早就認(rèn)為其有扶助正氣、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功效，對(duì)其藥性和功效已做了詳盡的記述[1]。靈芝在我國南嶺以南的兩廣、福建和臺(tái)灣南部以及海南、香港地區(qū)均有分布，盛產(chǎn)于廣東、廣西等地，資源十分豐富。文獻(xiàn)記載靈芝具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心臟、消除自由基、抗衰老和促進(jìn)造血功能等作用[2-4]。靈芝的鎮(zhèn)痛抗炎作用雖已有人研究，但用水提物和醇提取物同時(shí)觀察鎮(zhèn)痛抗炎這方面較少，為此，我們用靈芝實(shí)體水提取物和醇提取物同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)性炎癥的抗炎鎮(zhèn)痛這方面的實(shí)驗(yàn)，為靈芝的鎮(zhèn)痛抗炎提供資料，更為靈芝的利用提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 藥物 野靈芝實(shí)體，2014年9月27日購自百色市右江區(qū)城鄉(xiāng)路4號(hào)百色市民健大藥房。

1.2 藥物制備 靈芝實(shí)體提取物：取靈芝實(shí)體剪碎100 g加入10倍的蒸餾水，放于常溫下4 h，然后用慢火煮沸1 h，冷卻后用干凈紗布過濾，保留濾液；濾渣再加500 ml蒸餾水，再用慢火煮沸1 h，冷卻后過濾，保留濾液，合并兩次濾液，最后濃縮至100 ml(1 ml含生 藥1 g)，作為靈芝提取物，置于冰箱4℃?zhèn)溆谩ｌ`芝實(shí)體100 g，用醇提法，乙醇濃度75%、8倍量、回流2次、每次1 h，制備成1 g/ml藥材的醇提取液，置于冰箱4℃?zhèn)溆谩０⑺酒チ帜c溶片：江蘇平光制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)140111，加生理鹽水配制成0.5 mg/ml的阿司匹林腸溶液，備用。冰醋酸：濃度≥99.5%，廣東省汕頭市西隴化工廠有限公司，批號(hào)0808042；配制成0.6%的醋酸溶液，備用。二甲苯：濃度≥99.0%，廣東省廣州新建精細(xì)化工廠，批號(hào)20060322。

1.3 動(dòng)物 小白鼠，昆明種，6～8周齡，雌雄兼有，體質(zhì)量(22±2)g，均由本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SYXK2011-0010)。

1.4 儀器 智能熱板儀(YLS-6A)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn)；電子分析天平(ME104/02)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)GB/T23111。

1.5 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

1.5.1 醋酸扭體法 選擇體重(22±2)g健康小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，分別為陰性對(duì)照組(生理鹽水組)、水提取物組 (1 g/ml)、醇提取物組(1 g/ml) 以及陽性對(duì)照組(阿司匹林0.5 mg/ml)，共4組。按劑量0.2 ml/20 g給小鼠灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，最后一次給藥1 h后腹腔注射0.6%醋酸溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)0.2 ml ，仔細(xì)觀察注射醋酸溶液后各組表現(xiàn)出的扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的時(shí)間及小鼠15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，便于對(duì)藥物的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。扭體反應(yīng)抑制率的計(jì)算如下：

抑制百分率(%)=[(對(duì)照組平均扭體數(shù)-給藥組平均扭體數(shù))/對(duì)照組平均扭體數(shù)]×100%。

1.5.2 熱板法 首先把智能熱板儀調(diào)熱到(55±0.5)℃。然后取數(shù)只雄性小鼠，依次放在熱板儀上，按“開始”鍵記錄時(shí)間，從把小鼠放入熱板儀到出現(xiàn)舔足現(xiàn)象的時(shí)間(s)作為該鼠的痛閾值，凡是逃避或于5～30 s內(nèi)不出現(xiàn)舔足現(xiàn)象的小鼠舍棄不用。然后取篩選合格的雄性小鼠40只，分組同上。連續(xù)灌胃5 d，最后一次給藥分別在1 h、2 h后測(cè)定各鼠痛閾值。

1.6 抗炎實(shí)驗(yàn) 小鼠耳廓腫脹法：選擇體重(22±2)克健康小鼠40 g，雌雄各半，分組同上。連續(xù)灌胃5 d，最后一次給藥1 h后，涂二甲苯0.02 ml于小鼠右耳兩面致腫，以左耳不涂為正常作為對(duì)照。4 h后脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，用9 mm打孔器在左、右耳廓相同部位打一圓片，分別置于電子天平上稱重，記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算腫脹度及抑制率，比較各組差異。

腫脹度=[(右耳重量-左耳重量)/左耳重量]×100%；腫脹抑制率=[(對(duì)照組平均腫脹度-實(shí)驗(yàn)組平均腫脹度)/對(duì)照組平均腫脹度]×100%。

2 結(jié)果

2.1 靈芝實(shí)體提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響 對(duì)水提取物組、醇提取物組、阿司匹林組、生理鹽水組4組扭體次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.5，P<0.001)，采用LSD法對(duì)水提取物組、醇提取物組、阿司匹林組分別與生理鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；水提取物組、醇提取物組與陽性對(duì)照阿司匹林組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，兩種靈芝實(shí)體提取物對(duì)醋酸引起的疼痛均有顯著作用，與阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用相當(dāng)，見表1。

表1 靈芝提取物對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響 (n=10)

注：與生理鹽水組比較，a：P<0.01

2.2 靈芝實(shí)體提取物對(duì)小鼠熱板法的鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)水提取物組、醇提取物組、阿司匹林組和生理鹽水組4組痛閾值比較，在2h內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.74，P<0.05)。水提取物組、阿司匹林組在1h、2h內(nèi)均能明顯提高小鼠的痛閾值，與生理鹽水組比較只在2h內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，水提取物組與阿司匹林組(按小鼠體重5g/kg給藥)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而靈芝醇提取物組與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與阿司匹林組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，靈芝水提取物對(duì)提高小鼠的痛閾值有顯著作用，與阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用相當(dāng)；而靈芝醇提取物對(duì)小鼠痛閾值則無明顯作用，鎮(zhèn)痛作用不如水提取物和阿司匹林，見表2。

表2 靈芝提取物對(duì)小鼠熱板法的鎮(zhèn)痛作用 (n=10)

注：與生理鹽水組比較，a：P<0.05；b：P<0.01

2.3 靈芝實(shí)體提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)水提取物組、醇提取物組、阿司匹林組和生理鹽水組4組小鼠耳腫脹度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.19，P<0.05)。靈芝水提取物組、醇提取物組、阿司匹林組(按小鼠體重5g/kg給藥)與生理鹽水組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；水提取物組與阿司匹林組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而醇提取物組與阿司匹林組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，靈芝提取物對(duì)二甲苯所致炎性水腫有顯著性抑制作用，且其醇提取物優(yōu)于阿司匹林，見表3。

表3 靈芝提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 (n=10)

注：與生理鹽水組比較，a：P<0.05；b：P<0.01

3 討論

疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，是由于痛覺感受器受到刺激而產(chǎn)生興奮信號(hào)，經(jīng)傳入神經(jīng)到達(dá)大腦皮層所引起的一種不舒適的感覺。本研究中鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)表明靈芝提取物對(duì)理化因素致痛有一定的鎮(zhèn)痛效果。靈芝實(shí)體水和醇提取物均能明顯減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，而水提取物更能明顯延長熱刺激小鼠痛閾值。表明靈芝實(shí)體提取物對(duì)不同理化因素刺激引起的疼痛均有良好的鎮(zhèn)痛效果，在臨床上可用于消減炎癥反應(yīng)引起的疼痛。而且靈芝水提取物的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于醇提取物。

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)，紅、腫、熱、痛和功能障礙是其局部臨床表現(xiàn)的特征。在炎癥初期，血管受到理化因素的刺激，血管內(nèi)皮組織間隙擴(kuò)大，血管壁通透性增高，白細(xì)胞和蛋白質(zhì)等成分滲出到組織間隙，造成組織腫脹[5]。本實(shí)驗(yàn)表明靈芝實(shí)體提取物能顯著抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹的炎癥反應(yīng)，體現(xiàn)了其較好的抗炎作用。醇提取物與水提取物、阿司匹林相比，抗炎作用更優(yōu)。

靈芝屬真菌，含有以多糖為主的多種化學(xué)成分，其中如水溶性多糖GL-1具有抗腫瘤活性，靈芝多糖A、B、C具有降血糖活性，以及多糖BN3C3具有促進(jìn)核酸蛋白質(zhì)合成代謝作用、改善造血功能；在靈芝的子實(shí)體、菌絲體、孢子粉及發(fā)酵液中還分離得到100余種三萜類成分；除此之外，王培珍[6]發(fā)現(xiàn)靈芝還含有麥角甾醇、有機(jī)酸、生物堿、香豆精和氨基酸等成分；其多糖具有激活免疫細(xì)胞提高抗炎作用的免疫功能[7]。有研究表明靈芝具有鎮(zhèn)痛抗炎作用[8-9]。但他們都是以靈芝水提取物觀察對(duì)模型小鼠的作用，而對(duì)靈芝醇提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)研究則分別制備靈芝水提取物和醇提取物，并分別觀察這兩種提取物對(duì)模型小鼠的作用，就兩種提取物對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛抗炎作用的效果進(jìn)行比較觀察。發(fā)現(xiàn)靈芝提取物劑量在10g/kg時(shí)，水和醇提取物均能明顯減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，但水提取物更能明顯提高小鼠溫度痛閾值。雖然兩種提取物均能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，但醇提取物組與水提取物組、阿司匹林組相比，抗炎作用更優(yōu)。靈芝的鎮(zhèn)痛抗炎作用，初步分析其提取物可能含有揮發(fā)油作用于神經(jīng)中樞及外周系統(tǒng)，其成分中的蛋白多糖等可使致炎模型的巨噬細(xì)胞、多形多核細(xì)胞CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加而增強(qiáng)免疫作用。同時(shí)提示雖靈芝實(shí)體水、醇提取物對(duì)炎癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用，但各有側(cè)重。本實(shí)驗(yàn)的開展為靈芝的鎮(zhèn)痛抗炎研究提供較為詳實(shí)的資料。

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[2] 孟玉娥.識(shí)得靈芝需慧眼(之三)——靈芝的藥理作用[J].生態(tài)文化，2011(3):38-40.

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Analgesic and anti-inflammatory effects of Ganoderma lucidum
entities extract on experimental inflammation

Yang Wenbao1, Huang Qiuju1, Liang Caimei1, Liu Haiyan1, Zhao Shanmin2

(1.UndergraduateofClinicalMedicine,Grade2012,DepartmentofClinicalMedicineScience,YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,Guangxi,ChinaE-mail:635957824@qq.com;2.DepartmentofPhysiology,YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,Guangxi,China)

Objective To observe the analgesic and anti-inflammatory effects of water/ethanol extract of Ganoderma lucidum entities on experimental inflammation, and to preliminarily study its mechanism. Methods Water extract and 75% ethanol extract of Ganoderma lucidum entities were prepared for analgesic and anti-inflammatory experiments. Analgesic experiments were performed by using acetic acid twisting method and hot plate method, and an anti-inflammatory experiment was performed by using mouse auricle swelling induced by xylene. Results The water/ethanol extract of Ganoderma lucidum entities could obviously inhibit mice body twisting induced by acetic acid (P<0.01);Ganodermaextractat1h, 2haftertreatmentcouldobviouslyincreasethepainthresholdofmiceinthehotplatetest, (P<0.05orP<0.01);butwaterextractofGanodermalucidumwasmoreeffectivethanethanolextractofGanodermalucidum.BothwaterandethanolextractofGanodermalucidumcouldinhibitmouseauricleswellingcausedbydimethylbenzene(P<0.05orP<0.01),butethanolextractwasmoreeffectivethanwaterextract. Conclusion Water/ethanol extract of Ganoderma lucidum entities has significant analgesic and anti-inflammatory effects on experimental inflammatory animal models.

Ganoderma lucidum entities; extracting solution; analgesia; anti-inflammation; mice

2014年右江民族醫(yī)學(xué)院校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目(XJCXB201405)

E-mail：shengliymcn@126.com

R

A

1001-5817(2015)06-0769-03

10.3969/j.issn.1001-5817.2015.06.002

2015-09-29；

2015-11-22