RHDV VLPs對口蹄疫病毒B細(xì)胞表位的展示效果

胡 波， 盛 蓉，2， 宋艷華， 范志宇， 魏后軍， 薛家賓， 王 芳

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種具有高度傳染性、高發(fā)病率、高致死性的疾病，主要發(fā)生于2月齡以上成年兔［1-2］。兔出血癥病毒屬于杯狀病毒屬，無囊膜，直徑為35～40 nm［3-6］。病毒衣殼由180個衣殼蛋白組成，表面有32個高5～6 nm的圓柱狀殼粒，具有嵌杯樣病毒典型的杯狀結(jié)構(gòu)形態(tài)［7］。RHDV衣殼蛋白VP60由579個氨基酸組成，是病毒衣殼組成的最基本單位。

衣殼蛋白VP60是病毒的免疫保護(hù)性抗原，與誘導(dǎo)機(jī)體抗感染免疫直接相關(guān)［8］，單獨表達(dá)VP60蛋白能夠自聚成病毒樣顆粒(VLPs)。目前研究學(xué)者已采用多種異源系統(tǒng)對VP60進(jìn)行表達(dá)，如桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)［9-10］、酵母表達(dá)系統(tǒng)［11］和植物［12］等。通過這些系統(tǒng)表達(dá)獲得的重組VP60蛋白免疫動物后能夠抵抗病毒的感染，提供完全的免疫保護(hù)。目前VP60 VLPs作為表位載體和基因轉(zhuǎn)移載體的相關(guān)研究結(jié)果表明，可在VP60 N、C末端區(qū)域以及306～307 aa位插入外源片段，且不破壞病毒樣顆粒的形成，為其發(fā)展成為攜帶多表位的載體疫苗提供了依據(jù)［6，13-14］。

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)復(fù)合多表位可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［15-17］，O型FMDV至少有5個B細(xì)胞表位，其中包括VP1的141～160位(G-H環(huán))和C端200～213位氨基酸殘基線性表位，這2個表位是FMDV最重要的抗原位點［18］。本研究將FMDV VP1 2個B細(xì)胞表位串聯(lián)后［GS-(200～213 aa)-GS-(141～160 aa)］插入VP60的C末端(位于VLPs的表面)、N末端(位于VLPs的內(nèi)部)和306～307 aa之間，構(gòu)建一系列嵌合VP60蛋白，并將嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠，檢測機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生針對VP60和FMDV表位的特異性免疫應(yīng)答，分析VLPs對外源表位的遞呈能力，以及外源片段對VLPs的形成及其自身免疫特性的影響，為VP60 VLPs作為外源表位載體展示系統(tǒng)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞和實驗動物

載體pFastBacTMHTA購自Invitrogen公司，質(zhì)粒pFastBac1-VP60由本實驗室構(gòu)建并保存［8］;E.coli DH5α感受態(tài)購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司;E.coli DH10 Bac感受態(tài)由本實驗室保存;Sf9昆蟲細(xì)胞由本實驗室培養(yǎng)。7～8周齡ICR雌性小鼠，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 主要試劑與工具酶

DNA Marker DL2000及DL15000、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、SalⅠ、XbaⅠ、HindⅢ)、T4 DNA連接酶、凝膠回收純化試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司，PfxDNA聚合酶、Taq高保真酶、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和Grace’s不完全培養(yǎng)基購自invitrogen公司，柱式質(zhì)粒DNAout試劑盒、柱式動物RNAout試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，胎牛血清購自GIBCO公司，酶標(biāo)兔抗小鼠IgG(FITC-IgG)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。小鼠抗VP60單抗A3C為本實驗室制備保存［19-20］。

1.3 引物設(shè)計

1.3.1 設(shè)計合成引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫RHDV皖阜株VP60序列(FJ794180)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由Invitrogen公司合成，引物序列見表1。

1.3.2 合成FMDV B細(xì)胞表位序列 FMDV VP1 B細(xì)胞表位的雙串聯(lián)序列［GS-(411～1 060 aa)-GS-(200～213 aa)-GS］，簡稱FB，由Invitrogen公司合成。序列為:GTCGAC GGCAGCGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTC TGCCAGGCAGCCGTCACAAACAGGAAATCGTAGCTC CAGTAAAACAGAAGTTGGGCAGCTCTAGA(下劃線部分是GS linker，斜體部分是酶切位點)。

表1 試驗中所用引物序列Table 1 The sequences of primers used in the study

1.4 重組穿梭載體的構(gòu)建

1.4.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 以VP60-F和VP60-1R為引物，質(zhì)粒pFastBac1-VP60為模板，擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Sal I酶切后克隆至pFastBacTMHTA中，酶切鑒定后獲得重組轉(zhuǎn)移載體，命名為pFastBacTMHTA-1;以VP60-NF和VP60-3R為引物，以質(zhì)粒pFastBac1-VP60為模板，擴(kuò)增含有Xba I和Hind III酶切位點的PCR產(chǎn)物，并克隆至pFastBacTMHTA中，得到的重組轉(zhuǎn)移載體命名為pFastBacTMHTA-2。以VP60-F和VP60-2R為引物，質(zhì)粒pFastBac1-VP60為模板，擴(kuò)增VP60 1～918 bp片段，經(jīng)EcoR I和Sal I酶切后克隆至pFastBacTMHTA中，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTA-3。此外，以VP60-2F和VP60-3R為引物，擴(kuò)增獲得VP60 918～1 740 bp片段，經(jīng)Xba I和Hind III酶切后克隆至pFastBacTMHTA-3中，得到重組轉(zhuǎn)移載體，命名為pFastBacTMHTA-4。FMDV(O/China/5/99 strain) B細(xì)胞表位［FB(GS-(141-160 aa)-GS-(200-213 aa)-GS)］由人工合成，F(xiàn)MDV-F/FMDV-R經(jīng)退火處理后形成雙鏈(Sal I/Xba I)，用T4 DNA Ligase將Sal I/Xba I酶切消化后的載體(pFastBacTMHTA-1、pFastBacTMHTA-2和pFastBacTMHTA-4)與退火磷酸化處理的FMDV VP1 B細(xì)胞表位雙鏈DNA連接，形成3種重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBacTMHTA-VP60-2FB、pFastBacTMHTA-VP60-578FB 和 pFastBacTMHTAVP60-306FB。嵌合體結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

1.4.2 重組穿梭載體的構(gòu)建 制備E.coli DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)化3種重組轉(zhuǎn)移載體，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有3種抗生素(50 μg/ml卡那霉素、7 μg/ml慶大霉素、10 μg/ml四環(huán)素)、100 μg/ml X-gal和20 μg/ml IPTG的LB平板，37℃培養(yǎng)48 h后，挑選白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。用M13/PUC通用上下游引物對提取的重組穿梭載體進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行測序，重組穿梭質(zhì)粒分別命名為Bacmid-VP60-578FB、Bacmid-VP60-2FB和Bacmid-VP60-306FB。

圖1 嵌合體VP60-2FB、VP60-306FB和VP60-578FB示意圖Fig.1 The schematic diagram of the chimeric constructs (VP60-2FB，VP60-306FB and VP60-578FB)

1.5 VP60-VLPs的表達(dá)和鑒定

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將鑒定為陽性的重組穿梭載體(Bacmid-VP60-578FB、Bacmid-VP60-2FB和 Bacmid-VP60-306FB)用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后每12 h觀察1次，細(xì)胞病變明顯時收集細(xì)胞及上清液，作為重組桿狀病毒原液，4℃保存。將獲得的重組桿狀病毒分別命名為 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB和 rAcV-Bac-2FB。將第1代病毒液反復(fù)凍融3次后以1%體積比接種Sf9細(xì)胞，進(jìn)行傳代，得到第2代重組病毒。

1.5.2 間接免疫熒光檢測 3種重組病毒分別感染24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，同時設(shè)置空白對照(正常細(xì)胞)和陰性對照(感染野生型桿狀病毒)，本實驗室構(gòu)建的rAcV-Bac-VP60作為陽性對照。在感染Sf9細(xì)胞24 h后，加入預(yù)冷的乙醇固定液，4℃作用1 h;PBS洗滌3次，分別以1∶200稀釋的RHDV單抗A3C和1∶100稀釋的?！癘”型FMDV多抗血清為一抗，37℃孵育細(xì)胞1 h;隨后用PBS反復(fù)洗滌3次，分別對應(yīng)加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG和FITC標(biāo)記的羊抗牛IgG為二抗，37℃作用1 h。多次充分洗滌，防止留有非特異性熒光，在熒光顯微鏡下觀察。

1.5.3 SDS-PAGE和Western blot分析 收集感染重組病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融處理后加入上樣緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)印NC膜，封閉后，分別以1∶200稀釋的RHDV單抗A3C和1:100稀釋的牛源“O”型FMDV多抗血清為一抗，分別對應(yīng)以HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG和HPR標(biāo)記的羊抗牛IgG為二抗，最后DAB顯色。

1.6 電鏡觀察

分別將重組病毒接種Sf9細(xì)胞，細(xì)胞明顯病變后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融后離心取上清，經(jīng)超濾管濃縮，6 000 r/min離心7 min，濃縮10倍后備用。將待檢樣品滴于載樣銅網(wǎng)上，吸附作用2 min;將2%的磷鎢酸染液滴于銅網(wǎng)上，固定2 min;最后除去多余的磷鎢酸染液，室溫干燥5 min，于H-7650型透射電鏡上進(jìn)行觀察。

1.7 嵌合蛋白免疫特性研究

1.7.1 抗原的制備 3種重組桿狀病毒分別接種對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，出現(xiàn)明顯病變后，用滅菌PBS(pH 7.4)重懸細(xì)胞。反復(fù)凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片，取上清經(jīng)超濾管純化濃縮，用無菌PBS將嵌合蛋白稀釋為400 μg/ml。按抗原、弗氏佐劑1∶1體積比混合，乳化后備用。1.7.2 動物免疫 7-8周齡雌性ICR小鼠共36只，隨機(jī)分成6組，分別經(jīng)腹腔注射乳化后的嵌合蛋白VP60-2FB、VP60-306FB、VP60-578FB、VP60、FMDV滅活疫苗和PBS，每只200 μl(40 μg)。共免疫3次，每次免疫間隔2周，首次免疫采用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全佐劑。其中PBS組為陰性對照，VP60組為檢測VP60特異性抗體的陽性對照，F(xiàn)MDV組為檢測外源B細(xì)胞表位應(yīng)答的陽性對照。于首免后第0、1、2、3、4、5和6周對小鼠進(jìn)行斷尾采血，分離血清，采用本實驗室建立的檢測VP60特異性抗體水平的間接ELISA方法［21］，檢測各組免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生VP60特異性抗體的水平;利用O型FMDV ELISA檢測試劑盒(購自武漢科前生物制品有限責(zé)任公司)檢測FMDV VP1 B細(xì)胞表位特異性抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得及其鑒定

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫RHDV皖阜株VP60序列(FJ794180)，設(shè)計引物，以pFastBac1-VP60為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得符合目的片段大小的條帶(圖2)。

圖2 重組VP60基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of recombinant VP60 gene

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體的鑒定

將酶切處理的目的基因與pFastBacTMHTA進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒。分別利用限制性內(nèi)切酶對3種重組陽性質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見2條大小分別為4 775 bp和1 800 bp左右的條帶(圖3)，證明目的片段已成功克隆至載體pFastBacTMHTA中。

2.3 重組穿梭載體的鑒定

利用pUC/M13上、下游引物對重組Bacmid質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約為4 000 bp，而以同樣引物對空Bacmid質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約為300 bp;以目的基因上、下游引物對重組Bacmid質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為1 800 bp左右的條帶，證明轉(zhuǎn)座成功。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion

2.4 嵌合蛋白的表達(dá)和鑒定

將重 組 病 毒 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB、rAcV-Bac-2FB和rAcV-Bac-VP60分別感染Sf9細(xì)胞，其中rAcV-Bac-VP60為陽性對照。感染24 h后，以RHDV單抗A3C為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行熒光染色。結(jié)果(圖4)表明，感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而感染野生型桿狀病毒的Sf9細(xì)胞和空白對照細(xì)胞無熒光，說明嵌合蛋白得到有效表達(dá)。

圖4 間接免疫熒光試驗(IFA)檢測3種嵌合VP60蛋白的表達(dá)Fig.4 Indirect immunofluorescence assay(IFA)analysis of the expression of chimeric VP60 proteins

將重組病毒 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB、rAcV-Bac-2FB和rAcV-Bac-VP60分別感染Sf9細(xì)胞，其中rAcV-Bac-VP60為陽性對照。感染24 h后，以牛FMDV多抗血清為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗牛IgG為二抗，進(jìn)行熒光染色。結(jié)果(圖5)表明，分別感染 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB和rAcV-Bac-2FB的Sf9細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而感染AcV-Bac-VP60、野生型桿狀病毒的Sf9細(xì)胞和空白對照細(xì)胞無熒光，說明嵌合蛋白攜帶的VP1 B細(xì)胞表位獲得有效的表達(dá)。

SDS-PAGE和Western blot結(jié)果(圖6)顯示:以VP60單抗A3C為一抗的NC膜在約6.0×104處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致，說明嵌合蛋白得到有效表達(dá);以FMDV牛多抗血清為一抗的NC膜同樣在6.0×104處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致，說明FMDV B細(xì)胞表位得到有效表達(dá)，且免疫印跡與電泳的目的條帶位置相符。

圖5 IFA檢測3種嵌合蛋白中B細(xì)胞表位的表達(dá)Fig.5 IFA analysis of the expression of B cell epitope in chimeric proteins

圖6 3種嵌合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.6 SDS-PAGE and Western blot analysis of the chimeric proteins

2.5 電鏡觀察結(jié)果

電鏡觀察結(jié)果(圖7)顯示，本試驗構(gòu)建并表達(dá)的3種嵌合蛋白均可形成大小約為40 nm的VLPs，形態(tài)和大小均與天然RHDV VLPs的粒子(陽性對照)相似，說明外源表位的插入未影響VP60自身VLPs的組裝。

2.6 嵌合蛋白誘導(dǎo)小鼠的體液免疫應(yīng)答

為檢測嵌合蛋白VP60刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，本研究用間接ELISA檢測方法測定小鼠血清中抗載體VP60的特異性抗體水平和抗外源FMDV B細(xì)胞表位的特異性抗體水平。實驗小鼠分為VP60-2FB組、VP60-306FB組和VP60-578FB組，同時設(shè)立VP60組和FMDV滅活疫苗組作為陽性對照，PBS組作為陰性對照。分別于首免后0、1、2、3、4、5、6周對各組小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:首免后4-6周，3種嵌合蛋白均可產(chǎn)生較強(qiáng)的VP60特異性抗體，與PBS組比較差異顯著(P＜0.05)(圖8);3種嵌合蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的表位特異性IgG抗體與VP60組相比差異顯著(P＜0.05)，VP60組未產(chǎn)生表位特異性抗體應(yīng)答，3種嵌合蛋白均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的表位特異性抗體應(yīng)答水平(圖9)。此外，與嵌合VP60組相比，作為陽性對照的FMDV商品化滅活苗組誘導(dǎo)產(chǎn)生的表位特異性IgG抗體水平顯著高于嵌合VP60組(P＜0.05)(圖9)。

圖7 RHDV VP60蛋白和3種嵌合蛋白病毒樣粒子的電鏡觀察結(jié)果Fig.7 RHDV VP60 protein and chimeric VP60 VLPs under electron microscopy

圖8 間接ELISA檢測小鼠血清中VP60特異性抗體水平Fig.8 The detection of anti-VP60 antibody level in the serum of mice by indirect ELISA

3 討論

杯狀病毒成球形或近球形，無囊膜，核衣殼呈二十面體對稱，由180個單一結(jié)構(gòu)蛋白組成，病毒核酸為單股、正鏈線性RNA(ssRNA)［22-26］。杯狀病毒的VLPs結(jié)構(gòu)簡單，由單一衣殼蛋白自行裝配而成，是一種研究VLPs的理想模型。很多病毒的宿主范圍很廣，不僅可以感染人類，而且可以感染多種動物，這就為VLPs作為疫苗和藥物的應(yīng)用帶來了機(jī)遇。開發(fā)一種多功能的VLPs展示平臺，從而可以避免體內(nèi)預(yù)先的中和抗體反應(yīng)對VLPs所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的限制，具有重要的意義。RHDV宿主專一性較強(qiáng)，只對兔易感，對人和其他動物不存在安全威脅; RHDV作為杯狀病毒的成員之一，其VP60可自行裝配形成VLPs，使RHDV VP60作為研究其他動物疾病甚至是人類疾病VLPs疫苗的研究模型成為可能，但其作為展示系統(tǒng)的可行性、效果及其適用范圍還需要進(jìn)一步研究。

圖9 間接ELISA檢測FMDV B細(xì)胞表位抗體水平Fig.9 The detection of anti-FMDV B cell epitope antibody level in the serum of mice by indirect ELISA

本研究通過插入外源表位(FMDV VP1 B細(xì)胞表位)構(gòu)建VP60嵌合蛋白，研究VP60作為載體遞呈外源表位的能力，分析外源表位的插入是否影響其自身病毒樣顆粒的形成，評價VP60作為外源表位展示系統(tǒng)的可行性。研究結(jié)果表明，3種嵌合蛋白均能夠有效表達(dá)并形成VLPs，說明在VP60蛋白的第306～307 aa、C端和N端插入42 aa外源片段均不影響VLPs的組裝，具備自我裝配能力是VLPs疫苗候選物的基本特性。

選擇口蹄疫病毒兩個重要的B細(xì)胞表位GS-(200～213 aa)-GS-(141-160 aa)作為外源插入表位，構(gòu)建VP60嵌合VLPs。通過IFA和Western blot試驗發(fā)現(xiàn)VP60嵌合VLPs獲得有效表達(dá)，并具有VP60特異性和FMDV表位特異性抗原反應(yīng)。動物試驗結(jié)果顯示，3種嵌合蛋白免疫的小鼠均能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的VP60特異性和表位特異性體液免疫應(yīng)答。綜上所述，VP60 VLPs能夠有效遞呈外源表位，刺激機(jī)體對外源B細(xì)胞表位產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，可作為異源抗原的展示載體。此外，我們在前期研究的基礎(chǔ)上，將單串聯(lián)的B細(xì)胞表位增加成雙串聯(lián)的B細(xì)胞表位，外源片段大小增加至126 bp，序列的增加不影響VLPs的形成和免疫原性，可見VP60-VLPs作為遞呈外源抗原的展示載體的容耐性較大，可容納至少42 aa的外源片段。

本研究以VP60-VLPs為基礎(chǔ)，通過在VP60 N端、C端和306～307 aa位插入雙串聯(lián)FMDV B細(xì)胞表位序列構(gòu)建嵌合VLPs，研究結(jié)果表明VP60的N端、C端和306～307 aa位置均適合外源氨基酸片段插入，嵌合VLPs均能夠進(jìn)行自我組裝，且能夠有效展示長度為42 aa的外源片段。此外，VP60作為載體所能容納的最長外源氨基酸片段長度仍需進(jìn)一步研究。

［1］ FERREIRA P G，COSTA-E-SILVA A，MONTEIRO E，et al.Transient decrease in blood heterophils and sustained liver damage caused by calicivirus infection of young rabbits that are naturally resistant to rabbit haemorrhagic disease［J］.Res Vet Sci，2004，76(1):83-94.

［2］ XU Z J，CHEN W X.Viral haemorrhagic disease in rabbits:a review［J］.Vet Res Commun，1989，13(3):205-212.

［3］ ABRANTES J，VAN DER LOO W，LE PENDU J，et al.Rabbit haemorrhagic disease(RHD)and rabbit haemorrhagic disease virus(RHDV):a review［J］.Vet Res，2012，10(43):12.

［4］ COOKE B D.Rabbit haemorrhagic disease:field epidemiology and the management of wild rabbit populations［J］.Rev Sci Tech，2002，21(2):347-358.

［5］ CHEN M，SONG Y，F(xiàn)AN Z，et al.Immunogenicity of different recombinant rabbit hemorrhagic disease virus-like particles carrying CD8+T cell epitope from chicken ovalbumin(OVA)［J］.Virus Res，2014，183:15-22.

［6］ CRISCI E，ALMANZA H，MENA I，et al.Chimeric calicivirus-like particles elicit protective anti-viral cytotoxic responses without adjuvant［J］.Virology，2009，387(2):303-312.

［7］ VALICEK L，SMID B，RODAK L，et al.Electron and immunoelectron microscopy of rabbit haemorrhagic disease virus(RHDV)［J］.Arch Virol，1990，112(3-4):271-275.

［8］ 金明蘭，侯繼波，鄭其升，等.兔出血癥病毒VP60蛋白T細(xì)胞表位優(yōu)勢區(qū)的篩選［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(4): 186-188.

［9］ 王 芳，胡 波，任雪楓，等.兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及對家兔的免疫保護(hù)效果［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39(10):1382-1387.

［10］PLANA-DURAN J，BASTONS M，RODRIGUEZ M J，et al.Oral immunization of rabbits with VP60 particles confers protection against rabbit hemorrhagic disease［J］.Arch Virol，1996，141(8): 1423-1436.

［11］FARNOS O，RODRIGUEZ M，CHIONG M，et al.The recombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein obtained from Pichia pastoris induces a strong humoral and cell-mediated immune response following intranasal immunization in mice［J］.Vet Microbiol，2006，114(3-4):187-195.

［12］FERNANDEZ-FERNANDEZ M R，MOURINO M，RIVERA J，et al.Protection of rabbits against rabbit hemorrhagic disease virus by immunization with the VP60 protein expressed in plants with a potyvirus-based vector［J］.Virology，2001，280(2):283-291.

［13］LAURENT S，KUT E，REMY-DELAUNAY S，et al.Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of N-terminal domains dispensable for assembly［J］.Arch Virol，2002，147(8):1559-1571.

［14］BARCENA J，VERDAGUER N，ROCA R，et al.The coat protein of rabbit hemorrhagic disease virus contains a molecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid［J］.Virology，2004，322(1):118-134.

［15］DIMARCHI R，BROOKE G，GALE C，et al.Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide［J］.Science，1986，232(4750):639-641.

［16］BAXTER R，CRAIGMILE S C，HALEY C，et al.BoLA-DR peptide binding pockets are fundamental for foot-and-mouth disease virus vaccine design in cattle［J］.Vaccine，2009，28(1):28-37.

［17］ZHANG H Y，SUN S H，GUO Y J，et al.Immune response in mice inoculated with plasmid DNAs containing multiple-epitopes of foot-and-mouth disease virus［J］.Vaccine，2003，21(32): 4704-4707.

［18］WONG H T，CHENG S C，CHAN E W，et al.Plasmids encoding foot-and-mouth disease virus VP1 epitopes elicited immune responses in mice and swine and protected swine against viral infection［J］.Virology，2000，278(1):27-35.

［19］蔡少平，王 芳，賈華敏，等.兔出血癥病毒膠體金免疫層析試紙條診斷方法的建立及初步應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，43 (11):1795-1801.

［20］楊廷亞，王 芳，姜 平，等.應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選兔出血癥病毒抗原模擬表位［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，43(8): 1281-1286.

［21］李超美，王 芳，蔡少平，等.檢測兔出血癥病毒抗體間接ELISA方法的建立［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26(3):546-550.

［22］DI MARTINO B，MARSILIO F，ROY P.Assembly of feline calicivirus-like particle and its immunogenicity［J］.Vet Microbiol，2007，120(1-2):173-178.

［23］NICOLLIER-JAMOT B，OGIER A，PIROTH L，et al.Recombinant virus-like particles of a norovirus(genogroup II strain)administered intranasally and orally with mucosal adjuvants LT and LT(R192G)in BALB/c mice induce specific humoral and cellular Th1/Th2-like immune responses［J］.Vaccine，2004，22(9-10): 1079-1086.

［24］HAN M G，CHEETHAM S，AZEVEDO M，et al.Immune responses to bovine norovirus-like particles with various adjuvants and analysis of protection in gnotobiotic calves［J］.Vaccine，2006，24(3):317-326.

［25］SOUZA M，COSTANTINI V，AZEVEDO M S，et al.A human norovirus-like particle vaccine adjuvanted with ISCOM or mLT induces cytokine and antibody responses and protection to the homologous GII.4 human norovirus in a gnotobiotic pig disease model［J］.Vaccine，2007，25(50):8448-8459.

［26］PEREZ-FILGUEIRA D M，RESINO-TALAVAN P，CUBILLOS C，et al.Development of a low-cost，insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV［J］.Virology，2007，364 (2):422-430.