擬南芥AtLCR67干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

郭 磊，胡 佳，肖文娟，劉春林*

(1 作物資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室，長沙 410128； 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

擬南芥AtLCR67干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

郭 磊1，胡 佳1，肖文娟2，劉春林1*

(1 作物資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室，長沙 410128； 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

種子發(fā)育過程是植物整個生長周期最重要的階段，涉及到一系列功能物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化，是由各種相互關(guān)聯(lián)的基因共同控制完成的，因此，研究該階段特異性表達的基因?qū)ρ芯糠N子發(fā)育過程非常重要。以種子特異性表達的基因AtLCR67為研究對象，通過構(gòu)建RNAi干擾質(zhì)粒，借助根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法，將AtLCR67基因的RNAi表達框轉(zhuǎn)到擬南芥基因組中；經(jīng)過PPT抗性篩選與PCR鑒定，成功獲得了8株轉(zhuǎn)基因植株。對其中的3株進一步作RT-PCR檢測，顯示有2株中的AtLCR67基因表達被完全抑制，另一株的基因表達水平被抑制了大約70%，結(jié)果完全實現(xiàn)了設(shè)計目標；同時還發(fā)現(xiàn)T2代植株有晚花表型。這兩株轉(zhuǎn)基因植株為進一步研究AtLCR67功能與作用機制提供了良好的遺傳材料。

擬南芥；AtLCR67基因；RNAi質(zhì)粒；遺傳轉(zhuǎn)化；基因沉默

LCR(LOW-MOLECULAR-WEIGHTCYSTEINE-RICH)家族在擬南芥中有86個成員，其家族蛋白通常含有一段信號肽序列，一般都屬于分泌蛋白，分子量較小，都不超過12 kDa。多序列比對結(jié)果表明，除都含有8個高度保守的半胱氨酸外，家族成員的同源性較低。除LCR27和LCR71外，LCR家族其他基因都在靠近5′端有一段長約75～275 bp的內(nèi)含子序列[1]。LCR家族基因成員眾多，但是功能已知的不多。目前，在LCR家族中，了解的基因功能有兩個方面：植物防御和自交不親和。擬南芥LCR基因家族包含DEFL (Defensin-like)亞家族，稱為類防御蛋白，這一類蛋白與病原菌抗性相關(guān)，又稱為抗菌肽[2]。此外，LCR基因家族中還包含一些編碼PCP蛋白(Pollen coat protein)成員的亞家族。PCP蛋白是一種富含半胱氨酸的小分子量花粉外包壁蛋白，能與SLG(S-locus glycoprotein)和SLR1(S locus-related 1)相互作用，使成熟的花粉可以粘著在柱頭上順利完成花粉管的萌發(fā)以及受精[3]，避免了自交不親和現(xiàn)象(self-incompatibility，SI)。AtLCR67(AT1G75830)，又名AtPDF1.1，為擬南芥(Arabidopsisthaliana)LCR家族中DEFL亞家族的一員。氨基酸序列親緣關(guān)系分析結(jié)果，將AtLCR67聚類到DEFL亞家族，編碼了一種PR(pathogenesis-related) 蛋白，屬于植物防御(PDF)家族。AtLCR67在種子中特異性表達[4]，且在擬南芥種子發(fā)育過程中的第8～10階段表達量最高，在干種子與吸脹種子中有表達，其它組織中不表達(http：//www. arabidopsis.org/)。但是有研究證實用真菌感染擬南芥的葉片，在感染的部位AtLCR67會被誘導(dǎo)表達[5]，這表明AtLCR67在特殊情況下可以在種子之外起作用。此外，由于AtLCR67在正常生長情況下只在種子中表達，推測該基因很可能會參與擬南芥的胚胎發(fā)育或種子中儲存物的代謝物合成過程?？傊?，有關(guān)AtLCR67的確切功能至今尚不清楚。本研究采用RNAi原理[6]，通過構(gòu)建AtLCR67干擾質(zhì)粒，并且對哥倫比亞野生型擬南芥Col-0進行轉(zhuǎn)化，并通過篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，從而為深入研究AtLCR67基因的功能提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞生態(tài)型Col-0，大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，干擾載體pNapin-pFGC5941(為Napin2基因的啟動子替換了原有的CaMV35S啟動子)、T載體pMD-19，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的生長

用純水拌營養(yǎng)土，將擬南芥種子播于裝有營養(yǎng)土的小缽中，封保鮮膜保濕，避光4℃處理3 d，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室培養(yǎng)3 d后揭膜[7]，生長條件22～25℃[8]，長日照(16 h/8 h)，定期澆灌1/4MS營養(yǎng)液。

1.2.2 pAtLCR67RNAi質(zhì)粒設(shè)計

從TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站上查到AtLCR67的CDS序列，經(jīng)過同源性比對，選取了自ATG開始，特異性強的98 bp序列作為干擾片段。選擇經(jīng)改造的帶有Napin啟動子的pFGC5941為基礎(chǔ)載體。目標片段克隆引物序列如下：

pLCR67RNAiF：5′-GCTCTAGACCATGGATGGCTAAGTCTGC TACCATC-3′(下劃線標記為XbaI和NcoI酶切位點)

pLCR67RNAiR：5′-CGGGATCCGGCGCGCCC ACAACTTCTGT GCTTCCAC-3′(下劃線標記為AscI和BamHI 酶切位點)

擴增產(chǎn)物長度為128 bp。

1.2.3 pAtLCR67RNAi質(zhì)粒構(gòu)建

用Trizol[9]法提取擬南芥Col-0開花后10 d果莢的RNA。反轉(zhuǎn)錄出cDNA，并以此為模板，用引物pLCR67RNAiF/pLCR67RNAiR擴增出LCR67干擾片段。切膠回收后連接到T-載體pMD-19上，通過熱激法[10]轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR檢測出陽性克隆送測序。用NcoI和AscI雙酶切測序正確的pMD-19-LCR67 RNAi和Napin-pFGC5941，回收目的片段和目的載體，T4連接酶16℃連接過夜，獲得連接有正向干擾片段的Napin-pFGC5941載體，通過熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR檢測出陽性克隆，擴大培養(yǎng)后用OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。XbaI和BamHI雙酶切測序正確的pMD-19-LCR67RNAi反向片段和連有正向片段的Napin-pFGC5941?；厥漳康钠魏湍康妮d體，T4連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并通過酶切驗證確定載體構(gòu)建成功。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化

提取質(zhì)粒通過凍融法[11]將構(gòu)建好的質(zhì)粒pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，進行菌落PCR鑒定和雙酶切驗證。挑取正確的克隆于10 mL含有慶大霉素(30 mg/L)、卡那霉素(50 mg/L)、利福平(100 mg/L)的YEB培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm培養(yǎng)36 h。再將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至新50 mL YEB中擴大培養(yǎng)；用浸花法[12]轉(zhuǎn)化Col-0。浸染后的植株黑暗處理24 h后移到長日照條件下生長。待T0代種子成熟后，密集播種在裝有營養(yǎng)土的缽子中，待真葉長出后，用噴壺噴施1 mg/L PPT，每天1次，連續(xù)7 d，篩選到抗性苗后，將其單株移栽到新的缽子中培養(yǎng)，為T1代植株。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株AtLCR67干擾效果鑒定

用Trizol法提取T1代植株開花后10 d的果莢RNA，反轉(zhuǎn)出cDNA，通過RT-PCR比較AtLCR67在T1植株與Col-0的表達情況，從而判定pAtLCR67RNAi載體的干擾效果。若RT-PCR結(jié)果證實pAtLCR67RNAi干擾效果明顯，可進行定量PCR實驗，更加精確的了解其干擾程度。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定與表型觀察

經(jīng)過篩選得到的T1代植株在長日照條件下培養(yǎng)兩周后取其莖生葉，用CTAB法[13]提取其DNA為模板，以pLCR67RNAiF為上游引物，取pFGC5941上Intron的一段序列設(shè)計的Intron703R為下游引物，進行PCR檢測。Intron703R序列為：5′-CTCCATCTTATTCCCTCCGTTTCAC-3′。根據(jù)PRC結(jié)果確定抗性苗是否為轉(zhuǎn)基因植株，并對轉(zhuǎn)基因植株的表型進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

從Col-0開花后10 d的果莢中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用設(shè)計好的引物pLCR67RNAiF/ pLCR67RNAiR擴增出用于干擾的目的片段。目的片段連接到中間載體pMD-19上，測序，選擇測序正確的菌落提取質(zhì)粒。利用NcoI/AscI和XbaI/BamHI兩組雙酶切，先后將干擾片段正反向插入到CHAS intron的兩側(cè)，構(gòu)建AtLCR67基因的RNAi質(zhì)粒。通過PCR方法，及用NcoI/AscI，XbaI/BamHI兩組雙酶切pAtLCR67RNAi載體，結(jié)果與預(yù)期一致(圖1A)，表明AtLCR67RNAi質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1B)。

圖1 干擾質(zhì)粒 pAtLCR67RNAi酶切驗證及載體示意圖注：A圖為酶切驗證圖，M.Mark；1.NcoI和AscI雙酶切；2.XbaI和BamHI雙酶切；3.未酶切對照。B圖為pAtLCR67RNAi載體示意圖。

2.2 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子檢測

將構(gòu)建好的pAtLCR67RNAi質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化Col-0，收集T0代種子于營養(yǎng)土中密集種植，噴施PPT進行篩選，獲得8株抗性苗。用CTAB法提取1～8號抗性苗的DNA，以pLCR67RNAiF和Intron703R為引物進行PCR檢測(圖2)，結(jié)果顯示T1代1～8株抗性苗均為轉(zhuǎn)基因植株。

圖2 抗性苗PCR檢測結(jié)果注：M.Mark；1～8.陽性轉(zhuǎn)化子；+.陽性對照；—.陰性對照；WT.空白對照。

2.3 pAtLCR67RNAi干擾效果鑒定

用Trizol法提取T1代1，2，3號突變體和Col-0開花后10 d的果莢RNA，反轉(zhuǎn)出cDNA，通過qPCR比較AtLCR67在pAtLCR67RNAiT1代 1，2，3號植株與Col-0的表達情況，從而判定pAtLCR67RNAi載體的干擾效果。

結(jié)果顯示，1～3號轉(zhuǎn)化子中AtLCR67基因沒有表達，而Col-0中有表達(圖3)，說明pAtLCR67RNAi結(jié)構(gòu)對AtLCR67的干擾效果十分顯著。

圖3 pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株LCR67的表達

為了確定RNAi是否完全抑制了該基因的表達，增加了qPCR實驗(圖4)。結(jié)果表明pAtLCR67RNAi結(jié)構(gòu)在1號，3號植株中使AtLCR67表達完全沉默。qPCR所用引物及序列如下：

q-ACTIN2-F：5′-CTTGCACCAAGCAGCATGAA-3′

q-ACTIN2-R：5′-CCGATCCAGACACTGTACTTCCTT-3′

q-LCR67F：5′-ATGGCTAAGTCTGCTACCATC-3′

q-LCR67R：5′-CACAACTTCTGTGCTTCCAC-3′

圖4 pAtLCR67RNAi 1，2，3號轉(zhuǎn)基因植株LCR67 qPCR結(jié)果

2.4 pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株與Col-0表型對比

觀察pAtLCR67RNAiT1轉(zhuǎn)基因植株與同時種植的Col-0表型差異，發(fā)現(xiàn)其開花時間比Col-0晚7～10 d(圖5A)。為了排除人為篩選環(huán)境的影響，故收取T1代1號植株種子，單株種在小缽中，經(jīng)過PCR檢測確定其為轉(zhuǎn)基因植株后(圖5B)，與同時種植的Col-0對比觀察，發(fā)現(xiàn)AtLCR67RNAi-1 T2代植株也有晚花表型(圖5C)。

圖5 pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型觀察注：A圖為pAtLCR67RNAi T1代植株與Col-0表型對比。B圖為pAtLCR67RNAi-1 T2代植株P(guān)CR檢測電泳圖，圖中M為Mark；1～3，7～13為陽性轉(zhuǎn)化子；4～6為陰性轉(zhuǎn)化子；+為陽性對照；—為陰性對照；WT為空白對照。C圖為pAtLCR67RNAi-1 T2代植株與Col-0表型對比。

3 結(jié)論與討論

AtLCR67是擬南芥LCR家族的一員，由于AtLCR67特異在種子中表達，推測AtLCR67很可能與擬南芥的胚胎發(fā)育或種子中儲藏物的合成代謝相關(guān)。進一步驗證AtLCR67的功能，必須有該基因表達沉默的材料，而AtLCR67沒有可用的T-DNA插入突變體資源，故本實驗利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了特異沉默AtLCR67的干擾載體。實驗早期通過比對，發(fā)現(xiàn)AtLCR67與AT2G26020、AT5G44420同源性較高，但這兩個基因均特異性在幼葉中表達，而AtLCR67特異性在種子中表達，且本干擾載體啟動子為種子特異性表達基因Napin2啟動子，故可以保證該干擾片段只沉默AtLCR67。干擾載體pAtLCR67RNAi構(gòu)建成功后浸花轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0，經(jīng)過篩選及PCR檢測獲得8株轉(zhuǎn)基因植株。通過RT-PCR實驗初步證實pAtLCR67RNAi載體的干擾效果顯著，隨后通過qPCR進一步證實在1號、3號轉(zhuǎn)基因植株中AtLCR67被完全沉默，說明1號與3號材料可以作為AtLCR67基因沉默材料，這為深入研究AtLCR67的功能做好了基礎(chǔ)材料的準備。之后將對AtLCR67沉默突變體胚胎發(fā)育或種子中儲藏物的合成代謝進行研究，以證實AtLCR67是否參與這些生物過程。另外，值得一提的是，在對pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株進行表型觀察時發(fā)現(xiàn)相對于Col-0有晚花表型。為了排除篩選環(huán)境造成的影響，對T1代種子直接種植，經(jīng)過PCR篩選出轉(zhuǎn)基因植株，再與同時種植的Col-0對比，晚花表型依然存在。AtLCR67表達降低后導(dǎo)致植株出現(xiàn)晚花的原因尚不清楚，可能是胚胎發(fā)育或種子中儲藏物的合成代謝變化導(dǎo)致，具體機理需后續(xù)研究。

[1] Vanoosthuyse V，Miege C，Dumas C，et al.Two largeArabidopsisthalianagene families are homologous to theBrassicagene superfamily that encodes pollen coat proteins and the male component of the self-incompatibility response[J].Plant Molecular Biology，2001，46(1)：17-34.

[2] Silverstein KA，Graham MA，Paape TD，et al.Genome organization of more than 300 defensin-like genes inArabidopsis[J].Plant Physiology，2005，138(2)：600-610.

[3] Doughty J，Wong HY，Dickinson HG.Cysteine-rich pollen coat proteins (PCPs) and their interactions with stigmatic S (incompatibility) and S-related proteins inBrassica：putative roles in SI and pollination[J].Annals of Botany，2000，85(S1)：161-169.

[4] Sels J，Mathys J，De Coninck B，et al.Plant pathogenesis-related (PR) proteins：a focus on PR peptides[J].Plant Physiology and Biochemistry，2008，46(11)：941-950.

[5] De Coninck B，Sels J，Venmans E，et al.Arabidopsisthalianaplant defensin AtPDF1.1 is involved in the plant response to biotic stress[J].New Phytologist，2010，187(4)：1075-1088.

[6] Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA，et al.RNAi：double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell，2000，101(1)：25-33.

[7] 劉守偉，劉士勇.擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38(2)：279-281.

[8] 于政權(quán)，孫 穎.擬南芥菜室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)的改進[J].河北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1999，23(4)：549-550.

[9] 李 敏，楊 雙，阮燕曄，等.擬南芥T-DNA插入突變體atsuc3的PCR鑒定[J].植物生理學(xué)通訊，2006，42(1)：91-94.

[10] 王 萍，殷春燕，盈 磊.不同方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的研究[J].淮海工學(xué)院學(xué)報，2007，16(2)：55-58.

[11]張邊江，陳全戰(zhàn).質(zhì)粒導(dǎo)入不同種農(nóng)桿菌凍融法的探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46(3)：329-331.

[12]李 君，李 巖，劉德虎.植物遺傳轉(zhuǎn)化的替代方法及研究進展[J].生物技術(shù)通報，2011(7)：31-36.

[13]楊立國，楊 晶.5種常見植物DNA提取效率的比較[J].生物學(xué)通報，2012，47(9)：44-46.

The RNAi Plasmid Construction ofAtLCR67 and Identification of Transgenic Plants

GUO Lei1，HU Jia1，XIAO Wen-juan2，LIU Chun-lin1*

(1 Hunan Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Utilization，Hunan Agircultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agircultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

The processing of seed development is the most important stage for the whole life of plant growth，it depends on the synthesis and transformation of different kinds of metabolic controlled by corresponding genes.So study on the genes specifically expressed during seed developing stage is very important to understand the processing of seed development.AtLCR67 gene only expresses during the seed development stage was used as material，the RNAi expression box ofAtLCR67 gene was transferred toArabidopsisthalianagenome via construction of RNAi plasmid and agrobacterium-mediated transformations.Through resistance selection of PPT and PCR identification，eight transgenic plants were gained.The RT-PCR results of 3 plants selected from the transgenic plants showed that theAtLCR67 gene was silenced completely in 2 plants，and the expression level ofAtLCR67 gene was inhibited by about 70% in another one，which suggested the expression box ofAtLCR67 gene RNAi worked.By the way，the late-flowering phynotype of T2generation transgenic plants was found during the experiment.The two transgenic plants in whichAtLCR67 gene was silenced completely were the good materials for further research on function and action mechanism ofAtLCR67.

Arabidopsisthaliana；AtLCR67 gene；RNAi plasmid；genetic transformation；gene silence

2015-01-29

郭 磊(1989-)，男，山西靈石人，碩士研究生，Email：guolei0418@126.com。

*通信作者：劉春林，博士，教授，Email：liucl@hunau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目(31071455)。

Q78

A

1001-5280(2015)03-0221-05

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.03.01