沙門菌CRISPR 的結構與功能研究進展

蔡銀強，李求春，陶 靜，蔣道軍，潘志明＊，焦新安

（1.揚州大學江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009；2.揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇揚州225009；3.江蘇全福農(nóng)牧實業(yè)有限公司，江蘇溧陽213353）

沙門菌是全球范圍內(nèi)最重要的幾種食源性致病菌之一，給人類衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成了嚴重的經(jīng)濟負擔。在美國，沙門菌每年引起約140萬例感染事件，造成15 000人住院，超過400人死亡［1］。在中國，大約70%～80%的食源性疾病的暴發(fā)流行是由沙門菌引起的［2］。沙門菌可分離于多種食物（CDC 食源性疾病暴發(fā)在線數(shù)據(jù)庫http：／／wwwn.cdc.gov／foodborneoutbreaks／），同時，這些污染沙門菌食物的廣泛分布，使得在沙門菌食源性疾病暴發(fā)流行期間，人們很難對它們進行調(diào)查和溯源。

目前，已建立起多種鑒定沙門菌的方法，如傳統(tǒng)的生化鑒定、血清型鑒定及PCR 鑒定等。近年來，應用于沙門菌鑒定的方法，大多以核酸為基礎，包括環(huán)介導等溫擴增（loop－mediated isothermal amplification）［3］、實 時 熒 光 定 量PCR（real－time fluorescence quantitative PCR，real－time PCR）［4］、脈 沖 場凝 膠 電 泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）［5］、規(guī)律成簇間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）［6］等。PFGE目前被認為是食源性致病菌亞分型的金標準，并得到了廣泛應用。CRISPR 是細菌基因組中進化最快的一種遺傳元件，它普遍存在于約90%古細菌和40%細菌的基因組中，包括沙門菌［7］。近年來，CRISPR 的研究已成為生物界的一大熱點，沙門菌便是其中的一個代表。

1 沙門菌的CRISPR 系統(tǒng)

1.1 沙門菌CRISPR 位點的發(fā)現(xiàn)

1987年，Ishino Y 等［8］在對大腸埃希菌的堿性磷酸酶同工酶Ipa 所對應的核酸序列進行分析時，發(fā)現(xiàn)在該產(chǎn)物編碼區(qū)的下游存在著一個由29個堿基組成、重復出現(xiàn)的、并且高度保守的核酸序列；同時，在兩個重復的核酸序列之間，存在著長度大致相等、獨特的非重復核酸序列，將它們間隔開來。2000年，Mojica F J等［9］通過比對數(shù)種古生菌和細菌的核酸序列，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌和傷寒沙門菌的核酸序列中，存在著高度同源的大小為29bp的重復序列，當時稱之為SRSRs（short regularly spaced repeats，SRSRs）序 列，直 到2002 年，Jansen R 等［10］才 將 其正式命名為CRISPR，即規(guī)律成簇間隔的短回文重復序列，并一直沿用至今。

1.2 沙門菌CRISPR 位點的結構

在已發(fā)現(xiàn)的含有CRISPR 位點的細菌中，該位點的數(shù)量從1個～3個不等［11］。比較而言，沙門菌中普遍存 在2 個CRISPR 位 點［10］，由 前 導 區(qū)（leader），序列高度保守的重復區(qū)（repeat），以及間隔區(qū)（spacer）3個部分組成。其中，序列高度保守的重復區(qū)與間隔區(qū)交替出現(xiàn)，最終形成一個完整的CRISPR 位點。前導區(qū)一般位于CRISPR 位點的上游，由AT 富集的、大小為300bp～500bp的堿基組成。該區(qū)在種內(nèi)相對保守，但是在種間卻存在著顯著水平的差異［10］。研究表明，前導區(qū)的存在，很可能起著CAS（CRISPR－associated）相關蛋白的識別位點的作用。重復區(qū)一般由平均長度為29bp的堿基組成，序列高度保守，但也存在如其他細菌一樣的被稱為退化重復（degeneration repeats，DRs）的變異［12］。Touchon M 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，重復區(qū)的序 列具有二重對稱性，意味著它們能夠形成發(fā)夾般的、穩(wěn)定的二級結構；同時，重復區(qū)的數(shù)量與CAS系統(tǒng)的完整程度呈現(xiàn)正相關，即CAS系統(tǒng)越完整，CRISPR位點中的重復區(qū)數(shù)量越多；而在其他細菌中，尚未發(fā)現(xiàn)如此的規(guī)律。間隔區(qū)一般由平均長度為32bp的核苷酸序列組成，它們的插入和丟失，導致了沙門菌CRISPR 位點的多樣性，被形象地稱為“CRISPR 微進化”。值得注意的是，沙門菌的CRISPR 間隔區(qū)特有地與血清型密切相關，在一定程度上，可以用CRISPR 來代替沙門菌血清學分型［6］。在同一個CRISPR 中，基本上不存在相同或是較相似的間隔區(qū)。長期的研究表明，部分間隔區(qū)序列與已知的質(zhì)粒、噬菌體的序列相匹配［14］。目前，CRISPR Data－Base數(shù)據(jù)庫中的間隔區(qū)序列，僅存在約2%能在GenBank中找到其相應的匹配，其原因可能是目前全基因測序的噬菌體和質(zhì)粒還比較少。隨著全基因組測序技術的進一步發(fā)展，測序的噬菌體和質(zhì)粒越來越多，而相應匹配的間隔區(qū)比例也在不斷上升［15］。

1.3 沙門菌CRISPR／CAS系統(tǒng)的結構

盡管CRISPR 大量發(fā)現(xiàn)于多種古細菌和細菌中［7］，但是鑒于CRISPR 的非編碼區(qū)特性，如要發(fā)揮其功能，還必須依賴于其相關的蛋白。2002 年，Jansen R 等［10］對CRISPR 側翼序 列 進 行 比 對，發(fā) 現(xiàn)在不同的細菌基因組間，都含有4個基因；同時，這些基因表現(xiàn)出顯著的同源性，說明這些基因與CRISPR 位點存在很大的關聯(lián)。迄今為止，已鑒定出40多種與CRISPR 位點相關的、多樣化的cas基因［16］，它們主要編碼與CRISPR 相關的蛋白，這些蛋白存在RNA 結合蛋白、聚合酶等結構域，與核酸的重組修復等功能有關。每個CRISPR 位點都伴有一類特異的CRISPR 相關的cas基因。Marraffini L A 等［17］根據(jù)45種cas基因對應的CAS蛋白的序列同源性、組成情況和功能，將CRISPR 系統(tǒng)分成9種亞 型，即 Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apernn、Mtube和RAMP module。

在已測定的E.coli亞型的沙門菌中，CRISPR／CAS系統(tǒng)傾向存在于CRISPR1 位點的一側，且8個連續(xù)的cas基因按照cas2、cas1、cse3、cas5、cse4、cse2、cse1、cas3的順序排列［13］，與其他在染色體或質(zhì)粒上按照cas4－cas3－cas1－cas2順序排列的細菌略有不同，同時還存在諸如cas3及其后所有cas基因缺失等現(xiàn)象［6］。這些cas基因分為兩大類，各自編碼不同功能的蛋白質(zhì)。一類稱為核心基因，包括cas1～cas6，其中，cas1和cas2 基因編碼的蛋白，主要在新重復序列的獲得中發(fā)揮作用，cas3編碼的蛋白被預測具有核酸酶和解旋酶的功能，在靶標基因的剪切中扮演重要角色［18］。另一類稱為亞型特異性基因，包括cse、csy、csn、csd、cst等，其中只有少部分已經(jīng)確定。除cas基因以外，還存在另一類非cas基因。Medina Aparicio L等［19］發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門菌中的LeuO 和LRP基因，對于CRISPR 的活性具有直接的調(diào)控作用，參與crRNA 的加工、DNA 的剪切及調(diào)節(jié)外源DNA 的進入等。

2 沙門菌CRISPR 系統(tǒng)的作用機制與功能

2.1 CRISPR 系統(tǒng)的作用機制

CRISPR 的作用機制類似于免疫防疫，可分為適應階段、表達階段和干擾階段。①適應階段，CRISPR 系統(tǒng)將一段與入侵的質(zhì)粒亦或噬菌體上的同源短片段（原間隔序列proto－spacers），插入到前導序列與第一段重復序列之間，同時伴隨一次重復區(qū)的復制，進而形成了一個新的重復區(qū)－間隔區(qū)單元，使得CRISPR 基因座留下入侵的噬菌體或是質(zhì)粒的序列信息，為隨后的兩個階段提供結構基礎［20］。②表達階段，CRISPR 基因座被轉錄成一段長的CRISPR RNA（crRNA）前體（pre－crRNA），該前體在相應Cas蛋白的作用下，被切割并加工成小的、成熟的crRNA。隨后，成熟的crRNA 與Cas蛋白結合形成Cas／crRNA 蛋白復合體。③干擾階段，由crRNA 充當向導，Cas／crRNA 蛋白復合體找到與crRNA 同源的外源核酸靶序列，通過堿基互補配對原則進行配對，隨后Cas／crRNA 蛋白復合體將靶標序列降解。在CRISPR 免疫的3個階段中，適應階段的機制，在不同的CRISPR 系統(tǒng)中高度保守，主要通過Cas1和Cas2蛋白發(fā)揮功能。后兩個階段，不同于第一個階段，它們屬于執(zhí)行階段，在不同的CRISPR 系統(tǒng)中差異性較大，發(fā)揮作用的蛋白也有所差別［21］。

CRISPR 干擾與已發(fā)現(xiàn)的RNA 干擾有諸多相似性，但是它們在蛋白結構、作用靶標、防御機制等方面存在諸多差異。目前，已發(fā)現(xiàn)的CRISPR 的功能還僅僅局限于防御外源基因的入侵，而真核生物則能通過RNAi相關通路，調(diào)節(jié)胞內(nèi)的基因表達等［17］。

2.2 沙門菌CRISPR 系統(tǒng)的功能

除去與其他細菌CRISPR 類似的抵御外源質(zhì)粒和噬菌體DNA 的入侵的功能以外，沙門菌CRISPR還能介導自身短期表型的變化，也能介導長期的亞類進化［22］；同時，由于沙門菌的CRISPR 特有地與血清型密切相關，使得我們能在沙門菌食源性疾病暴發(fā)期間能快速地對其進行溯源。最近有研究表明，沙門菌的CRISPR 結構與它的耐藥密切相關。當然，更多的功能目前還尚不清楚，還有待進一步的研究。

3 CRISPR 在沙門菌分型中的應用

CRISPR 間隔區(qū)的插入及丟失，形成了間隔區(qū)特有的高度多態(tài)性，進而間接造成了CRISPR 的多元性。因此，可通過設計相應的引物，擴增細菌中的CRISPR 位點并測序，獲得CRISPR 序列信息，通過CRISPR 軟件分析，了解CRISPR 間隔區(qū)的數(shù)量，大小及排列情況。通過比對和分析這些序列信息，可對細菌進行分型研究。同時，鑒于間隔區(qū)在細菌核酸序列中是按照外源核酸序列入侵先后的順序排列，所以可利用CRISPR 對細菌進行遺傳進化研究。

2012年，F(xiàn)abre L 等［6］通 過 對783 株130 種 血清型的沙門菌進行CRISPR 分析，發(fā)現(xiàn)CRISPR 存在高分辨率，高實用性等優(yōu)點，與PFGE 相比，它能夠有效區(qū)分暴發(fā)流行中相同血清型的菌株，耗時更短，自動化程度更高，還能用于研究沙門菌的多態(tài)性；同時發(fā)現(xiàn)CRISPR 的多元性與血清型及ST 型（sequence type）密切相關。建議鑒于CRISPR 與血清型的高度相關性，只需根據(jù)兩個CRISPR 位點的大小，就能初步對沙門菌進行分型。其次，可以用軟件對CRISPR 位點的間隔序列進一步分析，得到更細致的分型結果。

CRISPR 除了單獨應用于沙門菌的分型之外，還能與其他分型方法聯(lián)用。近年來，基于沙門菌的兩個毒力基因（fimH，sseL）的MLST 及CRISPR 兩種分型方法的結合，建立了一種新的沙門菌分型方法，命名為CRISPR－MVLST，并成功應用于沙門菌的研究中。2011 年，Liu F 等［23］將該方法應用于171株9種血清型的臨床沙門菌分離株的分型研究，發(fā)現(xiàn)該方法較PFGE 而言，具有更高的分辨率，能將暴發(fā)菌株及高度克隆的菌株區(qū)分開來，可作為沙門菌暴發(fā)流行時一種重要的分型方法。2013年，Shariat N 等［24］將該方法應用于175株海德堡沙門菌和鼠傷寒沙門菌的分型研究中，表明該方法具有實用性強、分辨力高、流行病學一致性高等優(yōu)點，同時認為可以將該方法作為PFGE分型方法的一種補充，用于沙門菌的分型研究。

CRISPR 技術以核酸序列為基礎，具有良好的可操控性，可用于下游的進化分析。Fricke W F等［22］比對了28株沙門菌的基因組發(fā)現(xiàn)，CRISPR 介導的免疫能夠控制細菌短期的表型變化，也能介導長期的沙門菌亞類的進化，認為CRISPR 分析對評估沙門菌亞類的潛在進化性至關重要，能夠幫助和預防未來沙門菌的暴發(fā)流行。Timme R E 等［25］通過對156株78種血清型的腸道沙門菌進行序列測定，發(fā)現(xiàn)CRISPR 反映了與系統(tǒng)進化不同的進化模式，同時，有可能因為水平基因的轉移或共享環(huán)境的獲得，影響著目前沙門菌的分布情況。

4 小結與展望

在CRISPR 結構中，間隔區(qū)的插入和丟失、間隔序列與外源DNA 的高度同源性、cas基因家族及其所編碼蛋白的多種功能，使它被廣泛地應用于沙門菌及其他細菌的分型和進化分析研究。無論是單獨使用，還是與其他方法聯(lián)用，都表現(xiàn)出諸多優(yōu)越性。但是，現(xiàn)階段應用CRISPR 進行細菌分型研究，數(shù)據(jù)尚不充分，數(shù)據(jù)庫也不健全，還沒有形成特定的標準。另外，目前對于CRISPR 的研究還僅僅局限于它的防御機制，是否還有其他功能，以及已發(fā)現(xiàn)的關于CRISPR 的各種現(xiàn)象的原因，如新間隔序列的獲得及選擇性缺失，都未得到明確的解答。此外，迄今發(fā)現(xiàn)，CRISPR 只存在于90%的古細菌和40%的細菌，在數(shù)量上差異如此之大，是因為目前測序的細菌數(shù)量過少，還是由于與細菌共進化的噬菌體中，也存在CRISPR，亦或是存在類似于CRISPR 的其他元件，都值得探究。CRISPR 作為一個新的研究領域，鑒于它特殊的結構及強大的功能，應用前景廣闊。CRISPR 也許會像RNAi一樣，將揭開生物學領域的又一層面紗。

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