水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)及其育種應用的研究進展

吳 丹，姚棟萍，李鶯歌，吳 俊，伍富根，鄧啟云,3

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，湖南 長沙410128 ； 2. 雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙410125；3.中南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙410125）

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物之一，中國是世界上最大的水稻生產(chǎn)國。水稻的矮化育種和雜交水稻育種，實現(xiàn)了中國水稻單產(chǎn)的兩次跨越式發(fā)展。目前,我國正在醞釀著水稻育種的第三次飛躍，即以水稻亞種間雜種優(yōu)勢利用為主的超級稻育種[1]。但是秈粳亞種間雜交后代，存在結(jié)實率低、性狀不易穩(wěn)定和瘋狂分離等問題?；ㄋ幣囵B(yǎng)（花培）又叫單倍體培養(yǎng)，是用處于特定時期的花藥經(jīng)人工離體培養(yǎng)，使花藥中的花粉粒單性發(fā)育成單倍體植株的過程。單倍體植株經(jīng)過自然或人工處理，染色體加倍形成純二倍體，后代性狀穩(wěn)定。與常規(guī)育種方法相比，花藥培養(yǎng)技術(shù)有著可縮短育種年限、后代遺傳變異類型豐富、選擇效率高等優(yōu)點[2]。近年來，花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻育種中被廣泛研究。筆者從影響水稻花藥培養(yǎng)的因素、存在的問題以及下一步的研究方向等方面進行探討，以期為花藥培養(yǎng)實踐提供理論參考。

1 水稻花藥培養(yǎng)研究的回顧

日本學者新關(guān)宏夫于1968年用花藥離體培養(yǎng)首次得到了花培植株，開啟了花藥培養(yǎng)研究的先河[3]。我國水稻花藥培養(yǎng)的研究開始于1970年，1975年首次利用花培技術(shù)育成了粳稻新品種單豐1 號。之后研究者們紛紛開展提高水稻花培效率的相關(guān)研究，并將花藥培養(yǎng)技術(shù)與育種相結(jié)合[4]，在選育新品種，創(chuàng)新原始材料，不育系、恢復系的選育與提純方面，都取得了一定的成效。通過花藥培養(yǎng)相繼育成了一系列性狀優(yōu)良的品種，如中國農(nóng)業(yè)科學院選育的中花系列品種、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院選育的龍粳系列品種、天津市農(nóng)作物研究所選育的花育系列品種等[5]。目前，通過花培選育的常規(guī)水稻品種已有近40個。

亞洲栽培稻包括秈稻和粳稻兩大亞型。粳稻相對來講較易誘導，其花藥培養(yǎng)在育種中已取得良好的效果[6]。而秈型水稻，由于出愈率較低，有些材料甚至難以誘導出愈傷組織[7]，其花粉培養(yǎng)的株產(chǎn)率平均只有1%～3%[8]，所以花藥培養(yǎng)技術(shù)在秈稻育種中的應用還十分有限。目前，通過花培選育的秈稻品種還比較少，至20 世紀末僅有5個，且推廣面積都不大。突破秈稻花藥培養(yǎng)技術(shù)難點，加快秈稻花培在育種中的應用是當前水稻花培亟待解決的難題。

2 影響水稻花藥培養(yǎng)力的因素

2.1 基因型

供體品種的基因型是影響水稻花藥培養(yǎng)最關(guān)鍵的因素，不同基因型的水稻品種，其花藥培養(yǎng)力存在明顯差異。沈錦驊等[9]對比分析了各種類型的水稻材料之后，得出各類型水稻的花藥培養(yǎng)力由強到弱依次為糯稻＞粳稻＞秈粳型雜交稻＞秈稻，但不同材料之間差異較大。陳兆貴等[10]的研究表明，花藥培養(yǎng)力是受親本控制的遺傳性狀，如果父本和母本的培養(yǎng)力均較強，F(xiàn)1 代的培養(yǎng)力也會較強。并且有研究顯示，愈傷組織的誘導和綠苗的分化之間相關(guān)性顯著，且均是由多基因控制的數(shù)量性狀[11]。其中，影響花藥培養(yǎng)力的基因被認為在1 號染色體上，而控制綠苗與白苗分化比例的基因位于10 號染色體上[12]。何平等[13]對110個DH 系進行花藥培養(yǎng)力的數(shù)量性狀位點（QTLs）分析，得到了與愈傷組織誘導有關(guān)的5個QTLs，分別分布在第6、7、8、10 和12 號染色體上，與綠苗分化率有關(guān)的2個QTLs 分布在1 號和9 號染色體上。研究認為，如果將能提高愈傷誘導率和綠苗分化率的QTLs聚合在一起，篩選出愈傷誘導率和綠苗分化率均較高的材料，將大幅度提升花藥的培養(yǎng)力。

2.2 取材與預處理

單核靠邊期是水稻花藥培養(yǎng)的最佳時期?；ㄋ庍^老或過嫩，都會影響愈傷的誘導率。田間取樣的最佳時間一般為晴天的上午8︰00～10︰00 或下午16︰00～18︰00，此時細胞處于旺盛的分裂期。在試驗過程中，可通過某些器官的形態(tài)特征來判斷花藥的發(fā)育時期。通常，花藥的單核靠邊期，穗子苞大而不破，穎殼淺綠色，花藥淡黃色，花藥長度伸長至穎殼2/5～1/2處，劍葉與下一葉的葉枕距為5～10 cm[14]。但這種形態(tài)判斷指標比較粗放，不同的材料間存在較大差異，故不同的材料取材時要綜合衡量。

低溫預處理是提高花培效率最常規(guī)有效的手段，可使水稻愈傷組織誘導率提高幾倍至幾十倍。低溫處理的作用機制是延緩花粉的退化、維持花粉發(fā)育的生理環(huán)境、提高內(nèi)源生長素水平、降低乙烯含量、啟動雄核發(fā)育等。張躍非等[15]認為低溫預處理的最適溫度為8℃，時間以8 d 為宜。目前4℃處理7 d，或7～8℃處理8～10 d，都可獲得較好的效果。但最佳處理溫度和時間因材料而異，一般來說較低的處理溫度需要較短的放置時間，較高的處理溫度需要較長的放置時間。

2.3 培養(yǎng)基

2.3.1 培養(yǎng)基的種類與成分 培養(yǎng)基的類型也是影響水稻花培效率的重要因素之一。不同的試驗材料，適用的培養(yǎng)基不一樣。目前，還沒有一種萬能的培養(yǎng)基能適用于各種不同類型水稻材料的花藥培養(yǎng)。培養(yǎng)基中氨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例及氨離子的用量對花培的影響較大，秈稻氨離子以3.5 mmol/L 效果較佳，粳稻的則為7 mmol/L，秈粳交雜種的介于兩者之間。鎂離子的用量，對花培效率也有一定影響。朱至清等[16]的研究表明，鎂離子以2.2 mg/L 較好，不僅有利于愈傷組織的誘導，還有利于綠苗的分化。適宜的鐵離子濃度，也能夠提高花藥培養(yǎng)力。過壘生等[17]的研究表明，鐵離子的用量與2,4-D 的濃度有關(guān)。研究者為了得到最佳的培養(yǎng)效果，通過改變培養(yǎng)基中各組分的用量，設(shè)計了多種培養(yǎng)基。其中，N6 培養(yǎng)基適用于粳稻的花培，合5 培養(yǎng)基適用于秈稻[18]，改良的M 8、SK3培養(yǎng)基則對秈粳雜種有較好誘導效果[19]。馮雙華等[20]的研究表明，改良的M 8 培養(yǎng)基對基因型不同的材料有較廣泛的適應性。培養(yǎng)基的各種組分相互作用相互影響，如果要通過逐個試驗去找到每個元素的最佳用量，不僅工作量大，而且成效不一定顯著，因此在篩選培養(yǎng)基種類時抓住主次顯得尤為重要。

2.3.2 激素配比 花藥離體培養(yǎng)過程中，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的用量和配比對愈傷組織的誘導和綠苗的分化都至關(guān)重要。有研究表明，在只含2,4-D 的誘導培養(yǎng)基上，愈傷組織比較松軟，呈黏液化，較難分化。而在誘導培養(yǎng)基上添加NAA 和KT，可以改善愈傷組織質(zhì)量，提高愈傷組織的誘導率[21]。復合激素能顯著提高水稻花藥培養(yǎng)力，不同材料的最適激素種類及配比差異較大。馮雙華等在秈型水稻材料中，添加1.5 mg/L的2,4-D 和NAA 取得了較好的誘導效果。在培養(yǎng)基中添加KT 可以提高愈傷的誘導率，但是提高誘導率的同時也增加了白苗率?？傮w來說，秈稻所需要的激素含量更高，激素種類和配比因材料而異。

2.3.3 碳源與其他添加劑 碳源不僅提供能量，而且是培養(yǎng)基滲透環(huán)境的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)。糖類是主要的碳源，蔗糖被認為是植物組織培養(yǎng)的標準碳源，一般認為3%～6%的蔗糖為水稻花藥培養(yǎng)的常規(guī)用量。孫宗修等研究發(fā)現(xiàn)在麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上，愈傷組織平均誘導率顯著高于以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基。麥芽糖并不是適用于所有基因型的水稻材料，有些材料在麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上誘導出的愈傷組織質(zhì)量較差。另外，也有用砂糖做碳源取得較好誘導效果的研究報道。但可能是砂糖純度低，除了提供能量和滲透壓外，還補充了一些微量元素，從而提高了花藥的培養(yǎng)力。其他一些添加劑對于提高花藥培養(yǎng)力也有一定效果。在培養(yǎng)基中添加脯氨酸、水解酪蛋白、山梨醇等營養(yǎng)物質(zhì)，可以緩解愈傷長勢不好的狀況[22]。添加山梨醇可明顯改善愈傷組織生長狀況，提高其再分化能力；活性炭是最常用的添加劑，有研究表明，活性炭可以提高煙草花培的出苗率[23]。丁元豐等[24]認為活性炭對苗高、根長、根數(shù)和鮮重均有顯著促增作用。還有報道稱，鍺能夠降低白苗率，多效唑能明顯提高綠苗分化率和壯苗等[25]。馮英等[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加1 mg/L 的烯效唑（S-3307）能促進愈傷組織的誘導率和綠苗分化率。

3 水稻花培亟需解決的問題及對策

3.1 基因型的影響

基因型是影響水稻花藥培養(yǎng)力最關(guān)鍵的因素。秈稻花藥培養(yǎng)力很低，阻礙了其在育種上的應用。要提高秈稻的花藥培養(yǎng)力，最根本的辦法是通過雜交等遺傳改良手段，把高培養(yǎng)力基因?qū)氲絻?yōu)良親本或雜種中，通過改變基因型，來提高材料的花藥離體培養(yǎng)能力。但要通過這種辦法同時得到農(nóng)藝性狀良好，花藥培養(yǎng)力高的材料還存在一定困難。目前，常用的方法是從已有的優(yōu)良性狀材料中，篩選出花藥培養(yǎng)力高的材料進行花培。一般而言，粳稻花藥培養(yǎng)力大于秈稻，在育種中常以粳稻作為橋梁親本，來提高秈稻花藥培養(yǎng)力。但橋梁親本重復使用，會使遺傳血緣日益狹窄。如果以廣親和品種為橋梁親本，可在一定程度上減輕這一狀況。為了解決水稻遺傳背景貧乏的問題，可收集大量的野生稻做原始材料，進行廣親和性雜交研究，使花藥培養(yǎng)在材料上取得突破，以發(fā)揮花培育種的優(yōu)勢。

3.2 褐化

花藥的褐化是指花藥在培養(yǎng)過程中釋放褐色物質(zhì)，花藥逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象?；ㄋ幚锩娴男℃咦影l(fā)育需要花藥提供營養(yǎng)，誘導早期，花藥褐化，小孢子將會由于得不到充足的營養(yǎng)而退化，從而影響愈傷組織的誘導形成。褐變發(fā)生的條件很復雜，不只是多酚和多酚氧化酶直接作用的結(jié)果[27]。引起花藥褐化的因素很多，首先取材時期特別關(guān)鍵，單核靠邊期是花粉培養(yǎng)的最佳時期，過老的花藥在培養(yǎng)過程中更容易引起褐化。另外，光照過強和較高的培養(yǎng)溫度均會提高氧化酶的活性，從而促進酚類物質(zhì)氧化而引起褐化。還有研究表明，降低培養(yǎng)基中無機鹽濃度和微量元素錳的含量也可以降低褐化率。

3.3 白化

白化是指離體培養(yǎng)得到的幼苗整株或部分失綠，表現(xiàn)為白色或者黃色，白化植株的產(chǎn)生是禾本科植物花藥培養(yǎng)的特征之一。有研究認為，這可能是禾本科植物DNA 共同的特殊性，他們對離體條件十分敏感，易發(fā)生缺失或其他變異[28]?？臻g誘變能改善一些誘變材料的白苗分化率，但綜合性狀表現(xiàn)仍然較差[29]。陳啟偉等[30]認為液體培養(yǎng)基可以提高綠苗率。另外，降低培養(yǎng)基中無機鹽濃度和微量元素錳的含量，在不影響正常生長和分化的前提下降低溫度，減少光照均可以降低白苗率[31]。在誘導培養(yǎng)基中，添加過量的2,4-D或者KT，可提高愈傷組織的誘導率，但同時也提高了白苗率。因此，在培養(yǎng)過程中愈傷組織要給予充足的營養(yǎng)，減少不當?shù)拇碳?。目前，白苗現(xiàn)象仍然是一個難以解決的問題。

4 結(jié)語

雜交水稻育種從雜種優(yōu)勢利用水平上，分為品種間、亞種間和遠緣間雜種優(yōu)勢利用3個階段。品種間由于親緣關(guān)系較近使得雜種優(yōu)勢弱；亞種間尤其是秈粳間雜種優(yōu)勢更明顯，產(chǎn)量潛力大，但采用傳統(tǒng)方法來穩(wěn)定秈粳亞種間雜交后代性狀的時耗長、難度大，而花藥培養(yǎng)可加快后代性狀的穩(wěn)定速度，縮短育種時間。目前，大部分水稻的花藥培養(yǎng)力仍然較低，尤其是秈稻，很難滿足育種需求。攻克秈稻出愈率低、愈傷組織易褐化、白化等瓶頸，全面提升水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代育種的迫切要求?；蛐褪怯绊懟ㄋ幣囵B(yǎng)力的關(guān)鍵因素，但培養(yǎng)條件同樣重要?；蛐头矫妫蓮男誀顑?yōu)良的水稻材料中選擇花藥培養(yǎng)力高的材料進行培養(yǎng)，或通過導入高培養(yǎng)力基因來提高材料的花藥培養(yǎng)力。培養(yǎng)條件方面，取材時期、預處理、培養(yǎng)基、激素、添加劑，培養(yǎng)環(huán)境等均會影響花藥培養(yǎng)力，不同材料的適宜培養(yǎng)條件各異，所以要在前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上不斷探索，因材料而異地尋找某種或者某類材料的最佳培養(yǎng)條件。在今后研究中，要進一步研究花藥離體培養(yǎng)體系和遺傳機理等課題，完善花培育種模式，使花藥培養(yǎng)技術(shù)尤其是秈稻花培技術(shù)更加成熟，更好地為水稻育種服務。同時，也要將花藥培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因、分子標記等分子生物學技術(shù)相結(jié)合，加快育種進程，提高育種效率。

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