馬兜鈴酸檢測技術(shù)的研究進展

田 夢，瞿俊勇，馬 慧，張明軍

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙410128；2. 湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學院，湖南 長沙410127）

馬兜鈴酸（Aristolochic Acid，AA）是自然界中發(fā)現(xiàn)的第一種含硝基化合物，由3,4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生而來。馬兜鈴屬植物種類繁多、品種豐富。目前，已知品種超過了450種，而我國范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)有56種以上，且在各地均有分布，以西南及南部地區(qū)最多[1]。長期以來，含馬兜鈴酸的中草藥被廣泛應用于各種疾病的防治領(lǐng)域，但隨著臨床應用增多以及試驗研究的不斷深入，馬兜鈴酸的各種副作用和毒性被相繼報道出來[2]。于是，建立穩(wěn)定、可重復的馬兜鈴酸類物質(zhì)檢測體系十分必要。目前，馬兜鈴酸的分析檢測方法主要有薄層層析法、薄層掃描法、極譜法、HPLC法、熒光分析法、氣相色譜分析法、TLC-UV 分光光度法和二階導數(shù)光譜測定法等[3]。

1 馬兜鈴酸的分子結(jié)構(gòu)

馬兜鈴酸的結(jié)構(gòu)特點是C-1 有羧基，C-3、C-4 有次甲二氧基，見圖1。目前，已發(fā)現(xiàn)天然存在的馬兜鈴酸有A、B、C、D、E，7-甲氧基馬兜鈴酸，7-羥基馬兜鈴酸等，見圖2。對馬兜鈴酸類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析主要通過光譜解析，特別是氫核磁共振波譜法（1H-NMR）。由于該類型化合物的質(zhì)譜有較強的分子離子峰，因此很容易通過質(zhì)譜方法推定其分子式，再根據(jù)其基本母核通過1H-NMR 芳香質(zhì)子的解析，結(jié)合必要的去偶實驗，就可推定各個芳香質(zhì)子的位置，從而確定其結(jié)構(gòu)。

圖1 馬兜鈴酸的分子結(jié)構(gòu)式

2 馬兜鈴酸的檢測方法

2.1 高效液相色譜法

圖2 不同類型天然馬兜鈴酸分子的特殊基團

近年來，高效液相色譜法作為一種穩(wěn)定、可靠、高效的分析方法，在中藥材成分研究領(lǐng)域被廣泛使用，特別是對于成分差別細微的單味中草藥以及成分極為復雜的中藥復方制劑的鑒別領(lǐng)域。該方法的分離鑒別能力大大優(yōu)于其他鑒定方法，且具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高、準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

2.1.1 藥材及中藥組合中馬兜鈴酸類成分測定 葛孝忠等[4]建立了HPLC 法測定辛芩顆粒中馬兜鈴酸A的限度，檢測出馬兜鈴酸A 在細辛藥材和細辛顆粒中的回收率為98.1%和98.34%。吳艷蓉等[5]采用HPLC法對不同產(chǎn)地遼細辛種子以及果實中不同部位中的馬兜鈴酸A 含量進行了檢測，結(jié)果顯示遼細辛果實各部位中均含有馬兜鈴酸A，其中以種子中的含量最高，而不同產(chǎn)地遼細辛種子中馬兜鈴酸A 的含量有較大差異。韓娜等[6]采用RP-HPLC 法對14種中藥材中的馬兜鈴酸A 進行含量測定，結(jié)果顯示廣西山慈菇、短尾細辛、萬源山慈菇、苕葉細辛、關(guān)木通、尋骨風、川細辛、宜賓防己、淮通、廣元防己這10種中藥材中馬兜鈴酸A 的含量分別為0.13、0.15、0.18、0.22、0.49、0.52、0.58、0.72、0.94、3.00 mg/g，而平昌防己、冕寧防己、穆平馬兜鈴、北細辛這4種中藥材的地上及地下部分中均未檢出馬兜鈴酸A。王亮等[7]采用RP-HPLC法測定了不同劑量竹葉配伍關(guān)木通中馬兜鈴酸A 的溶出量，結(jié)果表明關(guān)木通中馬兜鈴酸A 的溶出量為0.106 mg/m L；竹葉與關(guān)木通以1∶4 的比例配伍，馬兜鈴酸A 的溶出量為0.041 mg/m L。

2.1.2 中成藥中馬兜鈴酸類成分測定 全世建等[8]采用RP-HPLC 法對關(guān)木通和龍膽瀉肝湯中各拆方組進行馬兜鈴酸A 測定，以觀察其變化趨勢，從而探討不同中藥配伍對馬兜鈴酸A 含量的影響。結(jié)果表明，與關(guān)木通相比，龍膽瀉肝湯的全方組中馬兜鈴酸A 的含量最低。倪琳等[9]用HPLC 法對五味渣馴丸中主要成分馬兜鈴酸A 進行定量分析，結(jié)果顯示，馬兜鈴酸A的線性范圍為0.024～0.247 μg（r=0.999 99），平均回收率為96.83%，相對標準偏差1.74%。葉志斌等[10]用HPLC 法測定了純陽正氣丸清寧丸、川芎茶調(diào)丸、龍膽瀉肝丸和關(guān)木通藥劑這4種中成藥中馬兜鈴酸A 的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同等條件下進行提取，關(guān)木通水煎劑中馬兜鈴酸A 的含量僅相當于甲醇提取液中的1/3；而川芎茶調(diào)丸、青寧丸和龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A 含量很低，關(guān)木通粗粉中馬兜鈴酸A 含量平均為0.23%。唐秀玲等[11]通過萃取、過固相萃取小柱對消腫止痛酊中馬兜鈴酸A 進行提取純化，應用HPLC 法對其進行檢測，結(jié)果表明，該方法可有效提取消腫止痛酊中的馬兜鈴酸A，同時該方法簡便快捷、重復性好、結(jié)果準確可靠，可作為控制消腫止痛酊安全性的檢測方法。陳娜娜等[12]采用超聲、固相萃取法對辛芩膠囊中馬兜鈴酸A 進行提取純化，在利用HPLC 法測定其含量，結(jié)果顯示，該方法簡便快捷、結(jié)果準確可靠，可用于辛芩膠囊中馬兜鈴酸A 的限量檢查。劉雅琳等[13]建立了馬兜鈴酸A 微量檢測體系，對目前使用的含馬兜鈴酸A 的中草藥材以及易與含馬兜鈴酸藥材混淆的中草藥材和中成藥進行檢測，結(jié)果表明該方法重復性好、靈敏度高，可用于含微量馬兜鈴酸A 中草藥材或中成藥限量檢測。阮葉萍等[14]采用RP-HPLC法，測定當歸四逆湯中各組分的馬兜鈴酸A 含量，發(fā)現(xiàn)當歸四逆湯全方中的馬兜鈴酸A 含量最低，關(guān)木通+補血組中的馬兜鈴酸A 含量也較低。

2.2 其他檢測方法

超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜檢測法（HPLCMS/MS）是一種分析速度快、定性準確的檢測方法，已在中藥質(zhì)量控制、中藥藥代動力學研究、中藥化學成分分析以及中藥代謝研究中廣泛使用。劉螢等[15]利用超高效液相色譜-電噴霧三重四極桿質(zhì)譜儀建立了中藥中馬兜鈴酸A 和B 的定性定量分析方法，結(jié)果表明該方法靈敏度高、重復性好、操作簡便，適用于中藥材/飲片及中成藥中馬兜鈴酸A 和B 的痕量檢測。周圍等[16]建立了中成藥中馬兜鈴酸A 的超高液相色譜-質(zhì)譜檢測方法，測定結(jié)果表明，馬兜鈴酸A 在超高壓液相色譜-質(zhì)譜的選擇離子記錄（SIR）中有較強的分子離子峰，檢出限為0.1 mg/kg，可以滿足中成藥中對馬兜鈴酸A 的測定要求。季文萱等[17]通過酶活化法和化學活化法使馬兜鈴酸A 與脫氧腺苷酸反應合成馬兜鈴酸A-DNA 加合物，優(yōu)化各種反應條件后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對合成的馬兜鈴酸A-DNA 加合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸A活化后能與腺嘌呤形成馬兜鈴酸A-DNA 加合物，LC-MS/MS 技術(shù)能夠快速方便準確地檢測馬兜鈴酸A-DNA 加合物。

紫外可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對波長為200～760 nm 這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。該方法主要依據(jù)物質(zhì)分子對不同波長和特定波長處的輻射吸收程度來測量物質(zhì)濃度。由于不同濃度的吸收光譜不同，可獲得不同吸收光譜的曲線，同時吸收峰數(shù)值與濃度成正比關(guān)系，從而通過峰數(shù)值來確定物質(zhì)的濃度。該方法操作簡單、準確度高、重現(xiàn)性好，應用范圍較廣。劉學湘等[18]采用反向HPLC 二元梯度洗脫法提取13種青木香發(fā)酵品中的馬兜鈴酸A，并采用紫外分光光度法測定這些發(fā)酵品中的總馬兜鈴酸含量，結(jié)果表明各種真菌發(fā)酵可在不同程度上降低中藥青木香中腎毒性成分馬兜鈴酸A 和總馬兜鈴酸的含量。張萍[19]采用紫外分光光度法測定馬蹄香不同部位馬兜鈴酸A的含量，結(jié)果表明馬兜鈴酸A 主要存在于馬蹄香的地下根部位；通過不同年份馬蹄香植物中馬兜鈴酸A 的含量比較分析，得出馬兜鈴酸A 在馬蹄香植物內(nèi)存在比較穩(wěn)定。

3 結(jié)語

越來越多關(guān)于馬兜鈴酸類物質(zhì)對人體危害性的報道，引起人們對馬兜鈴酸類物質(zhì)檢測技術(shù)的重視。對于已知含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的藥物，人們可以采取措施，棄用該藥或采用替代藥物，而對于未知的或是懷疑可能含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的非馬兜鈴科屬的中草藥，就可能存在疏忽遺漏。因此，建立一種可靠的方法來檢測疑似含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的中成藥和藥用植物，對于指導臨床采取防范措施以及更合理用藥具有重大意義?？偨Y(jié)前人的研究成果，筆者認為HPLC法是檢測馬兜鈴酸A 的有效方法，與其他方法相比，具有以下優(yōu)點：靈敏度高、分辨率高、樣品用量少、容易回收；樣品經(jīng)過色譜柱后不會被破壞，可以收集單一組分；速度快，通常一個樣品在15～30 min 內(nèi)即可完成檢測。

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