鴿蛋低密度脂蛋白對冷休克和凍融豬精子HSP70及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉 楊，黃和璐，董海濤，金 一

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002)

鴿蛋低密度脂蛋白對冷休克和凍融豬精子HSP70及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉 楊，黃和璐，董海濤，金 一*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002)

旨在探究鴿蛋低密度脂蛋白(LDL)對冷休克和凍融豬精子HSP70及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)分為5組，分別是鮮精組、3%LDL(-80和-196 ℃)處理組、9%LDL(-80和-196 ℃)處理組。采用CASA系統(tǒng)分析不同處理組添加不同濃度鴿蛋LDL對冷休克及凍融前后豬精子生物學(xué)性狀的影響；通過SDS-PAGE、Western blotting、PCR擴(kuò)增檢測分析HSP70蛋白及凋亡基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：豬精子經(jīng)過凍融處理后，熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量高于鮮精組，同時(shí)添加9%鴿蛋LDL并置于-196 ℃保存的凍融精子的熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量與鮮精組無顯著差異(P>0.05)；在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l試驗(yàn)中，鮮精組的基因表達(dá)量均高于其他處理組，添加9%LDL(-196 ℃)處理組的基因表達(dá)量與鮮精組無顯著差異(P>0.05)；在促凋亡基因Bak試驗(yàn)中，鮮精組的基因表達(dá)量最低，且添加9%LDL(-196 ℃)處理組的Bak基因表達(dá)量與鮮精組無顯著差異(P>0.05)。添加鴿蛋LDL可在一定程度上降低豬精子在凍融過程中造成的損傷，維持豬精子正常生物學(xué)性狀，提高豬精子存活率。

豬精子；冷休克；凍融；LDL；HSP70；凋亡相關(guān)基因；

人工授精使用的新鮮精液普遍面臨保存時(shí)間短的難題，釆集的新鮮精液經(jīng)過洗精稀釋處理，在15～20 ℃條件下只能保存3～5 d[1]，將精液冷凍才能達(dá)到長期保存的目的。目前關(guān)于牛[2]、羊[3]精液冷凍保存技術(shù)的研究已取得重大進(jìn)展，但在對豬精液冷凍保存方面的研究較少。J.M.Morrell等[4]研究結(jié)果表明，豬精子細(xì)胞膜的組成成分與牛精子有所不同，主要差異在于豬精子內(nèi)膽固醇與磷脂的比例較低，且細(xì)胞膜內(nèi)外的膽固醇含量不對稱。降低冷休克對豬精子的影響，并防止過氧化物對精子的損傷是豬精子冷凍保存的關(guān)鍵。冷凍解凍后豬精子細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致精子細(xì)胞膜破損、膜脂質(zhì)過氧化損傷，使精子質(zhì)量嚴(yán)重下降[5]。為了更好地適應(yīng)低溫環(huán)境，維持自身正常的生命代謝，精子內(nèi)部會發(fā)生一系列變化[6]，如溫度和滲透壓的變化等。但豬冷凍精液在解凍后仍存在活率低、受胎率低、窩平均產(chǎn)仔數(shù)少[7-8]的現(xiàn)象，因此尋找合適的冷凍保護(hù)劑是豬精液冷凍保存的主要研究方向。

卵黃是精液稀釋液的常規(guī)組分，卵黃中對精子起保護(hù)作用的有效成分是磷脂和低密度脂蛋白(LDL)[9]。侯麗鵬等[10]報(bào)道，鴕鳥蛋中提取的LDL對冷凍后的豬精子有一定保護(hù)作用，其中添加8 g·mL-1的LDL的效果最好，但鴕鳥蛋中提取的LDL的冷凍保護(hù)效果并沒有鴿蛋和雞蛋理想。

在凍融過程中，精子由于應(yīng)激會產(chǎn)生HSP70(Heat stress protein 70)，HSP70是由一個(gè)單一外顯子編碼的含有641個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[11]，可以通過增強(qiáng)細(xì)胞對外界損傷的耐受程度，維持細(xì)胞的正常代謝功能，且與哺乳動(dòng)物精子的生成密切相關(guān)[12]。目前對熱應(yīng)激蛋白的研究主要集中在人類及其他動(dòng)物的疾病方面，而對于熱應(yīng)激蛋白作用于精子的研究還處于起步階段。S.Y.Huang等[13]分析了HSP70的表達(dá)量和豬精液質(zhì)量之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在較為炎熱的季節(jié)，豬精子內(nèi)HSP70的表達(dá)水平顯著降低，這可能與精液質(zhì)量有關(guān)。M.D.Dun等[14]研究發(fā)現(xiàn)HSP70與新生多肽相關(guān)聯(lián)，有助于蛋白質(zhì)折疊，并且能夠在精子形成期間完成蛋白質(zhì)組裝。S.Nikbin等[15]研究結(jié)果表明，在熱帶地區(qū)HSP70的單核苷酸多態(tài)性可能會不同程度的影響精液品質(zhì)，尤其是對解凍后的精液品質(zhì)影響很大。M.Yeste等[16]研究也證實(shí)HSP70的表達(dá)可能會產(chǎn)生一種能夠包裹自身和外來抗原的新免疫物質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡。1972年J.F.Kerr等[17]根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，首先提出細(xì)胞凋亡(Apoptosis)一詞。Bak基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，但也受到同族的很多基因(如Bcl-2l、Bcl-xl)的影響[18]?？沟蛲龌駼cl-x1、Bcl-2l在人體的各個(gè)組織中都有不同程度的表達(dá)[19]。Bak可以單獨(dú)緩解Bcl-2l、Bcl-x1的抑凋亡活性，并且能夠直接激活凋亡途徑或是作為細(xì)胞死亡過程中的組成部分被活化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。凍融可導(dǎo)致豬精子的理化特性發(fā)生變化，并造成一定程度的損傷，加速精子死亡過程[20]。Y.J.Jeong等[18]發(fā)現(xiàn)精子生存能力的延長可能與促凋亡基因和抗凋亡基因的平衡有關(guān)。目前對于精液冷凍保存的研究，大多集中于不同稀釋液對精液冷凍質(zhì)量的影響以及對適宜冷凍稀釋液配方的研究。關(guān)于在稀釋液中添加不同成分提高精子活力的作用機(jī)理以及影響凍融后精子活力的相關(guān)基因、蛋白及其相互作用原理的研究相對較少。

本研究通過探究在凍融條件下向豬精子中添加不同濃度的鴿蛋LDL對豬精液品質(zhì)、頂體完整性、HSP70表達(dá)以及凋亡基因Bak、Bcl-x1、Bcl-2l表達(dá)的影響，進(jìn)一步為豬冷凍精液保存技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用豬精液均來自吉林省延吉市人工授精站的成年健康長白豬。采集的精液稀釋后用保溫瓶密封存放，在25 ℃條件下，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用于試驗(yàn)的精液必須符合：①顏色為乳白色；②活率>80%；③頂體完整性>75% 3個(gè)條件。

1.2 試驗(yàn)藥品

Tris、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaHCO3、KH2PO4、Hepes、EDTA、TEMED、二抗(Anti- Rabbit IgG peroxidase conjugate)均購自Sigma公司。預(yù)染 Marker、免疫印跡一抗HSP70、純化RNA試劑盒(High pure RNA isolation kit)、SYBR GreenⅠ染料均購自北京華夏遠(yuǎn)洋生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse transcription system)購自Promega公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

精子自動(dòng)分析儀(Computer aided sperm analysis，CASA)、超高速離心機(jī)、臺式微量高速離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、旋禍混合器、二氧化碳培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥箱、生物顯微鏡、振蕩儀、低溫高速離心機(jī)、垂直電泳槽、石墨半干轉(zhuǎn)膜儀、PCR擴(kuò)增儀。

1.4 溶液配置

PBS配制：NaCl 7.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g (或Na2HPO41.44 g)和K2HPO41.8 g，溶于800 mL蒸餾水，加蒸餾水定容至1 L。保存于4 ℃冰箱中即可。細(xì)胞裂解液配制：100 mL RIPA裂解液(強(qiáng))分裝1 mL·個(gè)-1，使用前加入PMSF，使PSMF的最終濃度為1 mmol·L-1?？贵w稀釋液(TBST緩沖液)：20% Tween 20 1 mL，TBS緩沖液400 mL，混合后即可使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。冷凍基礎(chǔ)液：TRIS 2.42 g、檸檬酸1.48 g、葡萄糖1.1 g 溶于100 mL去離子水中；冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液：冷凍基礎(chǔ)液中加20%雞卵黃(v/v)；冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液：冷凍基礎(chǔ)液中加9%甘油(v/v)；冷凍基礎(chǔ)Ⅲ液：冷凍基礎(chǔ)液中加入9% LDL；冷凍基礎(chǔ)液中加入3% LDL。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 LDL的提取 釆用M.Moussa等[21]方法提取LDL。收集鴿蛋卵黃，用等體積的NaCL溶液(0.17 mol·L-1)稀釋卵黃，4 ℃攪拌1 h。攪拌均勻后，4 ℃ 10 000 r·min-1離心45 min。取上清液，4 ℃ 10 000 r·min-1離心，至徹底除去卵黃中的顆粒物質(zhì)為止。取上清液加入等體積40%的(NH4)2SO4溶液，4 ℃攪拌1 h。攪拌均勻后，4 ℃ 10 000 r·min-1離心30 min。取上清液，透析6 h，然后4 ℃ 10 000 r·min-1離心30 min，離心分離后的上層漂浮物即為LDL。

1.5.2 精液冷休克處理 在平衡后的精液中分別加入含有3%和9%鴿蛋LDL的冷凍基礎(chǔ)Ⅲ液，置于計(jì)算機(jī)控制的水浴中，使精液迅速從室溫冷卻到4 ℃，移至4 ℃冰箱中平衡30 min，靜置待用。

1.5.3 精液凍融處理 精液經(jīng)過常溫保存液稀釋后，PBS洗滌，800 r·min-1離心10 min，去上清液，分別加入含有3%和9%鴿蛋LDL的冷凍基礎(chǔ)Ⅲ液，用紗布將試管包裹后放入冰箱，緩慢降溫至4 ℃，然后以2∶1(v/v)分別加入冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液?；靹蚝笱b入0.5 mL精細(xì)管中，分別置于-80和-196 ℃的低溫環(huán)境凍存。解凍時(shí)從液氮中取出精細(xì)管后快速放入42 ℃的恒溫水浴鍋中，解凍6 s后取出，將精液放入離心管內(nèi)，加入等體積的PBS，800 r·min-1離心10 min，除去上清液，添加等量的PBS重懸，800 r·min-1離心10 min，備用。

1.5.4 豬精子品質(zhì)檢測 對新鮮豬精子、冷休克豬精子(未添加LDL組、添加3%LDL和9%LDL組)、凍融豬精子(-80 ℃添加3%LDL和9%LDL組、-196 ℃添加3%LDL和9%LDL組)用CASA系統(tǒng)進(jìn)行檢測，檢測數(shù)據(jù)為重復(fù)3次以上的試驗(yàn)平均值。

1.5.5 考馬斯亮藍(lán)染色(CBB染色法) 吸取20 μL凍融豬精子：1)-80 ℃下添加3% LDL；2)-196 ℃下添加3% LDL；3)-196 ℃下添加9% LDL；4)-80 ℃下添加9% LDL)，用PBS重懸，涂片后晾干，用CBB染色液染色5 min，用三蒸水沖洗玻片，晾干后封片。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察豬精子頂體完整性。

1.5.6 精子全蛋白的提取 將不同處理組的豬精子用PBS洗滌，離心后用細(xì)胞裂解液重懸，置于搖床上震蕩20 min。裂解后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，-20 ℃凍存待用。

1.5.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 蛋白上樣量為30 μL，電泳條件為5%濃縮膠40 mA，10%分離膠80 mA，電泳3～4 h，觀察溴紛藍(lán)線移動(dòng)至距離凝膠板底部1 cm處即停止電泳，取出凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色，脫色。

1.5.8 免疫印跡(Western blotting) 剪20張濾紙和1張PVDF膜，大小與待轉(zhuǎn)印凝膠相同，將濾紙和PVDF膜在轉(zhuǎn)膜液中浸泡20 min。按照陽極、10層濾紙、PVDF膜、凝膠、10層濾紙、陰極的順序依次擺放。恒流電轉(zhuǎn)印25 min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用TBST洗膜，然后加包被液，室溫下平穩(wěn)搖動(dòng)2 h。棄包被液，用TBST洗膜。加入一抗，4 ℃放置12 h，棄一抗，用TBST洗膜。加入二抗，在室溫下平穩(wěn)搖動(dòng)2 h，棄二抗，用TBST洗膜。加入顯色液，避光顯色直到出現(xiàn)條帶，加入雙蒸水終止反應(yīng)，照相保存。1.5.9 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 引物由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 The primer sequence

基因Gene序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize登錄號AccessionNo.GAPDHSenseAntisenseCTGCCCCTTCTGCTGATGCGACAACTTCGGCATCGTGGA151AF017079BakSenseAntisenseACCGACCCAGAGATGGTCACCAGTTGATGCCACTCTCGAA209AJ001204Bcl-21SenseAntisenseGAAACCCCTAGTGCCATCAAGGGACGTCAGGTCACTGAAT196NM214285Bcl-x1SenseAntisenseCTGAATCAGAAGCGGAAACCGGGACGTCAGGTCACTGAA210AF216205

1.6 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄PCR及瓊脂糖凝膠電泳

采用純化RNA試劑盒(High pure RNA isolation kit)對不同處理組的豬精子進(jìn)行RNA提取。反轉(zhuǎn)錄PCR按照Reverse Transcription System試劑盒說明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：TaqDNA聚合酶0.08 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL、dNTP混合物0.4 μL、MgCl20.8 μL、反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2 μL，加無核酸的水至終體積為20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，57 ℃5 s，72 ℃10 s，循環(huán)數(shù)45～50；梯度擴(kuò)增；40 ℃30 s。分別取5 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件分析精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。通過方差分析并用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對豬精液品質(zhì)的影響

結(jié)果表明(表2～4)，不同處理對冷休克及凍融后豬精液品質(zhì)有不同程度的影響，鴿蛋LDL能對冷凍解凍后的豬精子活率產(chǎn)生較好的保護(hù)效果，-196 ℃溫度下添加9%鴿蛋LDL對解凍后豬精子活率、精子運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用最強(qiáng)，9%鴿蛋LDL對冷休克豬精子活率、精子運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用最強(qiáng)。

2.2 冷休克及凍融后豬精子頂體完整性評估

對不同處理組的冷休克及凍融豬精子用考馬斯亮藍(lán)染色方法染色，結(jié)果見圖1、圖2。頂體完整的標(biāo)準(zhǔn)：只有頂體為藍(lán)色，且頂體邊緣光滑的精子為具有完整頂體的精子類型。圖1結(jié)果顯示：冷休克后的豬精子組，除鮮精外，添加9%LDL處理組與其他組相比，具有較好的頂體完整性；圖2結(jié)果顯示：除鮮精外，凍融后的豬精子組，在-196 ℃下添加9%LDL的處理組與其他組相比具有較好的頂體完整性。

2.3 不同處理對HSP70蛋白表達(dá)量的影響

將5組豬精子樣本進(jìn)行SDS-PAGE分析，用HSP70抗體與酶標(biāo)二抗進(jìn)行處理，用GAPDH 做內(nèi)參，HSP70蛋白的SDS-PAGE結(jié)果以及免疫印跡結(jié)果如圖3，其中2、3、4、5處理組HSP70表達(dá)量略高于鮮精處理組；而4、5處理組間的表達(dá)量差異不明顯；LDL濃度相同時(shí)，-80 ℃溫度下，3、4處理組表達(dá)量高于-196 ℃的2、5處理組，溫度相同時(shí)，添加3%LDL的3、5處理組表達(dá)量高于添加9%LDL的2、4處理組，3處理組表達(dá)量最高，說明添加9%LDL、-196℃處理組的凍融精子與鮮精樣本最為相似。

2.4 凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l和Bak在不同處理組中表達(dá)

采用PCR擴(kuò)增和DNA電泳方法對5個(gè)處理組樣本抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l和促凋亡基因Bak進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果顯示，Bcl-xl、Bcl-2l鮮精處理組的基因表達(dá)量均高于其他處理組；添加9%LDL、-196 ℃的Bcl-2l凍融精子處理組的基因表達(dá)量略高于除鮮精外的其他3個(gè)處理組，3%LDL、-80 ℃處理組的基因表達(dá)量最低；添加9%LDL、-196 ℃的Bak凍融精子處理組的基因表達(dá)量略低于除鮮精以外的其他3個(gè)處理組；3%LDL、-196 ℃處理組的基因表達(dá)量最高。

表2 不同處理對冷休克后豬精液品質(zhì)的影響

Table 2 Effects of different treatments on quality of cold shock pig sperm

項(xiàng)目Item鮮精Freshsperm未添加LDLNotaddLDL添加3%LDLAdd3%LDL添加9%LDLAdd9%LDLA級精子比例/%ProportionofgradeAsperm65.10±9.33a9.40±1.14b10.10±5.46b18.90±1.52bB級精子比例/%ProportionofgradeBsperm13.40±1.53a5.30±5.03b4.90±4.28b7.40±3.67abC級精子比例/%ProportionofgradeCsperm16.00±4.56a38.80±8.68b42.00±5.47b47.50±4.74bD級精子比例/%ProportionofGradeDsperm5.40±4.01a46.60±0.83b42.90±1.83b26.10±1.71cVCL9/(μm·s-1)43.20±8.69a14.60±1.39b6.70±4.92b17.00±1.40bVSL/(μm·s-1)23.30±2.18a4.90±0.33b3.60±3.50b7.50±1.39bVAP/(μm·s-1)39.30±7.37a12.70±1.98b6.10±4.63b16.10±4.60b

同一行中肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。VCL9.平均曲線運(yùn)動(dòng)速率；VSL.平均直線運(yùn)動(dòng)速率；VAP.平均路徑運(yùn)動(dòng)速率；A級精子.快速向前運(yùn)動(dòng)的精子；B級精子.慢速或呆滯向前運(yùn)動(dòng)的精子；C級精子.非向前運(yùn)動(dòng)精子；D級精子.極慢或不動(dòng)的精子。下同

Different superscripts letters in the same line represents a significance at (P<0.05)；The same superscripts letters in the same line represents no significant difference(P>0.05).VCL9.Average curvilinear velocity；VSL.Average straight line velocity；VAP.Average path velocity；Grade A sperm.The sperm of fast forward movement；Grade B sperm.The sperm of slow or dead to move forward；Grade C sperm.The sperm of not fast forward movement；Grade D sperm.The sperm of extremely slow or does not move.The same as below

表3 不同處理對凍融豬精液品質(zhì)的影響

Table 3 Effects of different treatments on quality of frozen-thawed boar sperm

項(xiàng)目Item鮮精Freshsperm-80℃-196℃3%LDL9%LDL3%LDL9%LDLA級精子比例/%ProportionofGradeAsperm65.10±9.33a3.20±0.40b5.50±3.46b3.40±1.47b11.40±2.13bB級精子比例/%ProportionofGradeBsperm13.40±1.53a5.90±1.94b6.60±1.79b7.00±0.52b13.60±0.83bC級精子比例/%ProportionofGradeCsperm16.00±4.56a16.50±1.74a18.40±2.74a18.00±1.57a25.50±1.20abD級精子比例/%ProportionofGradeDsperm5.40±4.01a74.20±1.27b69.50±0.67c71.50±0.31bc50.30±0.67dVCL9/(μm·s-1)43.20±8.69a17.20±1.15b18.60±4.57b18.40±2.37b19.20±0.38bVSL/(μm·s-1)23.30±2.18a6.30±0.67b8.30±2.83b7.60±2.77b9.70±1.05bVAP/(μm·s-1)39.30±7.37a15.00±0.99b16.50±4.22b16.30±1.91b18.70±0.24b

表4 鮮精和添加LDL的凍融后豬精液品質(zhì)

Table 4 Sperm quality of fresh and LDL supplemented frozen-thawed boar semen

%

a.鮮精；b.未加LDL；c.添加3% LDL；d.添加9% LDL a.Fresh sperm；b.Not add LDL；c.Add 3% LDL；d.Add 9% LDL圖1 不同處理的冷休克豬精子考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 20×Fig.1 CBB staining on boar cold shock sperm with different treatments 20×

a.鮮精；b.3% LDL(-80℃)；c.9% (-196℃)；d.3% LDL(-196℃)；e.9% LDL(-80℃)a.Fresh sperm；b.3% LDL(-80℃)；c.9%(-196℃)；d.3% LDL(-196℃) ；e.9% LDL(-80℃)圖2 不同處理的凍融豬精子考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 20×Fig.2 CBB staining on boar frozen-thawed sperm with different treatments 20×

M.Marker；1.鮮精；2.9% LDL(-196℃)；3.3% LDL(-80℃)；4.9% LDL(-80℃)；5.3% LDL(-196℃)。下同M.Marker；1.Fresh sperm；2.9%LDL(-196 ℃)；3.3%LDL(-80 ℃) ；4.9%LDL(-80 ℃)；5.3% LDL(-196 ℃).The same as Fig.4圖3 5種處理豬精子HSP70蛋白表達(dá)的免疫印跡結(jié)果Fig.3 The results of the expression of HSP70 with 5 treatments by Western blotting

圖4 5種處理組豬精子凋亡基因的PCR結(jié)果Fig.4 The results of apoptotic gene with 5 treatments by PCR

3 討 論

3.1 溫度和鴿蛋LDL對豬精子品質(zhì)和頂體完整性的影響

精子活力及其運(yùn)動(dòng)性在凍融后普遍下降是因?yàn)閮鋈趯觾?nèi)的抗氧化酶造成持續(xù)性傷害，并引發(fā)更多活性氧(ROS)的產(chǎn)生，活性氧自由基會使精子膜上的脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷、凋亡甚至使精子基因變化。而LDL可在凍融過程中保護(hù)精子內(nèi)抗氧化酶的活性，從而有效提高精子活率。S.Büyükleblebici等[22]研究結(jié)果表明，在精液中補(bǔ)充不同抗氧化劑能夠降低頂體異常率。卵黃中對精子起冷凍保護(hù)作用的有效成分是磷脂和低密度脂蛋白(LDL)[23]。在豬精液的冷凍保存過程中，添加LDL能夠抑制脂質(zhì)過氧化，且對豬精子的活率以及活動(dòng)能力都有一定的保護(hù)作用[24]。本研究結(jié)果表明，添加9%鴿蛋LDL并置于-196 ℃的處理組對冷休克以及凍融后的豬精子活率、精子運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用最強(qiáng)。這與呂瑞凱等[25]研究證實(shí)的添加0.09 g·mL-1鴿蛋LDL的凍存豬精子解凍后，精子活率達(dá)到47.33%，頂體完整性達(dá)到62.57%結(jié)果基本相似，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于鴿蛋 LDL含有的特殊結(jié)構(gòu)，LDL含有0%～15%的蛋白質(zhì)和85%～90%的脂質(zhì)，并以甘油三酯為核形成一種膜狀物[26]。精子在凍融過程中，鴿蛋LDL的結(jié)構(gòu)損壞并破裂，使其內(nèi)部的甘油三酯和磷脂進(jìn)入精液，并在精子細(xì)胞外壁形成凝膠膜，以此降低凍融過程中物理和化學(xué)因素對精子造成的損傷。

3.2 溫度和鴿蛋LDL對HSP70表達(dá)的影響

熱休克蛋白具有的一些內(nèi)在和外在因素可能導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)損傷，阻礙蛋白質(zhì)合成，干擾細(xì)胞周期并引起細(xì)胞非正常凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致精子異常[27]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加9%鴿蛋LDL并置于-196 ℃條件下處理組凍融精子的HSP70表達(dá)量與鮮精樣本最為相似，并且隨著溫度的降低，HSP70的表達(dá)量逐漸降低，這與王艷風(fēng)[28]提出的隨著冷凍過程的進(jìn)行，HSP70基因的表達(dá)量逐漸降低，而新鮮精子的基因表達(dá)量顯著高于平衡后的精子(P<0.05)，平衡后精子基因的表達(dá)量又顯著高于解凍后的精子(P<0.05)的結(jié)論相似。說明豬精子在凍融過程中受到冷凍損傷后促使HSP70蛋白表達(dá)，這可能是由于細(xì)胞受到應(yīng)激傷害后，HSP70以分子伴侶的身份與異常蛋白質(zhì)分子的親水表面緊密結(jié)合，保護(hù)蛋白分子構(gòu)型以維持正常細(xì)胞的生存功能。添加9%鴿蛋LDL處理組的HSP70的表達(dá)量比添加3%鴿蛋LDL處理組的表達(dá)量高，這與D.Kong等[29]研究的添加9%鴿蛋LDL，200 mmol·L-1的海藻糖，9%甘油組合能保護(hù)凍融后精子的結(jié)果相似，說明鴿蛋LDL能夠在凍融過程中保護(hù)豬精子內(nèi)抗氧化酶的活性，避免精子損傷。江中良[30]研究LDL對豬精子凍融后凋亡樣變化產(chǎn)生的影響后證實(shí)，在豬精液冷凍稀釋液中添加不同濃度(6%～10%)的LDL，對促進(jìn)豬冷凍解凍后精子的存活，降低冷凍解凍誘導(dǎo)的凋亡樣變化以及與凋亡相關(guān)的部分基因的表達(dá)有明顯作用。HSP70的保護(hù)作用是通過促進(jìn)變性蛋白的復(fù)性來維持蛋白的正常結(jié)構(gòu)，或水解變性蛋白以促進(jìn)新老蛋白交替實(shí)現(xiàn)的。因此從各個(gè)角度深入研究HSP70對免疫學(xué)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗氧化、胚胎發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞周期等多個(gè)方面都將有重要意義。

3.3 溫度和鴿蛋LDL對豬精子抗凋亡基因Bcl-2l、Bcl-xl和促凋亡基因Bak表達(dá)的影響

研究表明，凍融可使人[31]、牛[32]精子細(xì)胞活性降低、線粒體膜電位降低等與細(xì)胞凋亡相關(guān)特征的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞中Bax基因表達(dá)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞凋亡加速。這似乎表明，Bax與Bcl-2l會組成異質(zhì)二聚體，進(jìn)而抑制Bcl-2l蛋白對細(xì)胞存活的影響[33]?？沟蛲龌駼cl-2l成員中的BH3結(jié)構(gòu)域是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域，可封閉促凋亡基因，并且從根本上阻止Bax和Bak基因的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生[33]。在本研究中，用PCR擴(kuò)增的方法分析凍融處理后豬精子凋亡基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示在抗凋亡基因Bcl-xl和Bcl-2l處理組中，鮮精處理組的基因表達(dá)量高于其他處理組，添加9%LDL、-196 ℃條件下凍融精子處理組的Bcl-xl、Bcl-2l基因表達(dá)量與鮮精組相似，說明在此溫度下9%鴿蛋LDL能夠降低細(xì)胞損傷，阻礙細(xì)胞凋亡，這與江中良[30]首次提出在冷凍保存后的豬精液中添加9%～10%的LDL后，BCL-2l的基因表達(dá)量顯著上升的結(jié)論基本相似。添加9%LDL、-196 ℃的Bak基因凍融精子處理組的基因表達(dá)量略低于除鮮精以外的其他3個(gè)處理組。這一結(jié)果似乎也表明凍融誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡廣泛存在，并與Y.J.Jeong等[24]研究發(fā)現(xiàn)的凍融過程可以誘導(dǎo)精子的凋亡相一致。似乎說明精子存活能力的延長可能與促凋亡基因和抗凋亡基因的平衡有關(guān)。造成以上原因的結(jié)果還需更深層次的研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)各處理組中豬精子熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量均高于鮮精組，其中添加9%鴿蛋LDL、-196 ℃凍融精子熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量與鮮精組無顯著差異；在抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l處理組中，鮮精處理組的基因表達(dá)量均高于其他處理組；而添加9%LDL、-196 ℃凍融精子處理組Bcl-2l基因的表達(dá)量與鮮精相似；添加9%LDL、-196 ℃凍融精子處理組的Bak基因表達(dá)量與鮮精最接近；且添加3%LDL、-196 ℃凍融處理組的Bak基因的表達(dá)量最高。

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(編輯 程金華)

Effect of LDL from Pigeon Egg Yolk on the Expression of HSP70 and Apoptosis-related Gene in Cold Shock and Frozen-thawed Boar Spermatozoa

LIU Yang，HUANG He-lu，DONG Hai-tao，JIN Yi*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China)

The purpose of this study is to investigate the effects of LDL from pigeon egg yolk on expression of HSP70 and apoptosis related genes in cold-shocked and frozen-thawed boar spermatozoa.This study divided into 5 groups：fresh sperm group，3% LDL(-80 and -196 ℃) treatment groups，9%LDL(-80 and -196 ℃)treatment groups.The addition of LDL with different concentrations has effect on biological features of the spermatozoa before and after cold-shock and frozen-thawed treatments ，which was analysed by CASA，and changes in expression of HSP70 and apoptosis-related genes were analysed and checked by SDS-PAGE，Western blotting and PCR.The results showed that：HSP70 expression was higher than that of fresh sperm after freezing，there was no significant difference between HSP70 expression of frozen-thawed stored at -196 ℃ with addition of 9% pigeon egg and fresh spermatozoa in treatment group(P>0.05)；in the experiment of anti-apoptosis geneBcl-x1，Bcl-21，gene expression in fresh sperm treatment group was higher than other treatment groups(P>0.05)；in the expression of pro-apoptoticBakgene，the expression of fresh sperm was the lowest，there was no significant difference betweenBakgene of the 9% LDL(-196 ℃) treatment group and fresh spermatozoa in treatment group(P>0.05).Addition of LDL from pigeon egg yolk could reduce the damage caused by freezing and thawing，maintain biological features and improve the survival of the pig spermatozoa.

boar spermatozoa；cold shock；LDL；frozen-thawed；HSP70；apoptosis-related gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.009

2015-01-15

國家自然科學(xué)基金(31260529)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204079NY)

劉 楊(1990-)，女，青海人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁殖與生物技術(shù)研究，E-mail：599295340@qq.com

*通信作者：金 一，教授，E-mail：yijin@ybu.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2015)06-0940-09