FSH、LH對體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及E2、P分泌功能的影響

徐庚全，樊江峰，2，楊世華，李谷月，趙華山，余四九，2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

FSH、LH對體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及E2、P分泌功能的影響

徐庚全1，樊江峰1，2，楊世華1，李谷月1，趙華山1，余四九1，2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

為了探明促卵泡素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體素(Luteinizing hormone，LH)對體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及甾體激素分泌的影響，揭示促性腺激素調(diào)控卵泡發(fā)育的機(jī)理，采用細(xì)胞培養(yǎng)和顯微觀察技術(shù)，建立了牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，觀察分析牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長特征和凋亡的形態(tài)特征；采用流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)和放射免疫測定技術(shù)(Radioimmunoassay，RIA)，分析了添加不同濃度的FSH和LH對牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)分泌的影響。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣細(xì)胞生長特性，具有典型的“S”形生長曲線，體外培養(yǎng)的牦牛顆粒細(xì)胞偶爾可見細(xì)胞核濃縮、邊集化、染色質(zhì)固縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松等凋亡的形態(tài)特征。在添加0.050～5.000 IU·mL-1FSH，隨著濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸降低，E2和P水平呈上升趨勢；在添加濃度達(dá)到5.000 IU·mL-1時(shí)，凋亡細(xì)胞比例最低降到7.3%，與對照組差異極顯著(P<0.01)。低濃度的LH(0.050～0.500 IU·mL-1)，可以抑制顆粒細(xì)胞凋亡，促使E2和P分泌增加；高濃度的LH(5.000 IU·mL-1)則促使顆粒細(xì)胞凋亡，對顆粒細(xì)胞分泌E2和P的影響不明顯。這一結(jié)果表明，F(xiàn)SH和LH可通過調(diào)節(jié)牦牛顆粒細(xì)胞的凋亡及分泌功能，在調(diào)控卵泡發(fā)育及排卵的過程中發(fā)揮重要作用。

牦牛；促性腺激素；顆粒細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；激素分泌

哺乳動(dòng)物卵巢上有大量處于不同發(fā)育階段的卵泡，但只有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵，大約99%的卵泡在發(fā)育的不同階段發(fā)生閉鎖[1-2]。卵泡閉鎖是卵泡從發(fā)育到排卵前所發(fā)生的退化并最終被清除的生理現(xiàn)象，主要通過細(xì)胞凋亡(Apoptosis)而實(shí)現(xiàn)，對維持卵巢內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動(dòng)[3]。顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要機(jī)制。在發(fā)育卵泡中，如果10%以上的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，那么該卵泡將注定發(fā)生閉鎖[4-5]。相反，顆粒細(xì)胞增殖和類固醇生成是卵巢功能維持和發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，卵泡的發(fā)育和排卵主要受促性腺激素的調(diào)控，尤其是FSH和LH在卵泡不同發(fā)育階段的變化規(guī)律已有報(bào)道?，F(xiàn)已普遍認(rèn)為，F(xiàn)SH 可以促進(jìn)有腔卵泡和排卵前卵泡的生長；少量的LH與FSH 協(xié)同促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟并分泌雌激素。另外在卵泡發(fā)育成熟時(shí)，LH 是觸發(fā)排卵的主要因素[6]。有關(guān)FSH和LH 對體外條件下卵泡顆粒細(xì)胞的作用未見報(bào)道。本試驗(yàn)在卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過添加不同濃度的FSH和LH，采用流式細(xì)胞技術(shù)和放射免疫技術(shù)，分析顆粒細(xì)胞的凋亡情況和分泌E2及P的能力，為卵泡閉鎖機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)方法

1.1 樣品采集

卵巢樣品采自甘肅省甘南藏族自治州瑪曲藏族自治縣屠宰場，母牦牛放血致死后，迅速采集卵巢組織，用滅菌PBS (pH7.2) 沖洗3次，放入含青霉素(100 IU·mL-1)和鏈霉素(100 μg·mL-1)的37 ℃ PBS緩沖液中，6 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

用帶12號(hào)針頭的注射器逐個(gè)抽吸2～6 mm卵泡中的卵泡液，加入15 mL離心管中，反復(fù)吹打使顆粒細(xì)胞充分分散后離心(1 000 r·min-1，5 min)，棄上清。細(xì)胞沉淀用含DMEM-F12(Gibco) 離心洗滌3次。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度到1.0×106mL-1，接種于60 mm 培養(yǎng)皿，置于 5% CO2培養(yǎng)箱中38.0 ℃培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并照相，記錄細(xì)胞生長情況。

1.3 生長曲線繪制

調(diào)整細(xì)胞密度到1×104mL-1、每孔1 mL接種于24孔板，接種時(shí)間記為0 d。從接種時(shí)間算起，每隔1 d用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞密度，并求出平均值，對每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)3次，取其平均值，檢測到第8天結(jié)束。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，取平均值繪制細(xì)胞生長曲線。繪圖法計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。

1.4 凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察

用于形態(tài)觀察的細(xì)胞，接種前事先在培養(yǎng)皿中放置蓋玻片，將細(xì)胞懸液接種于蓋玻片上，5% CO2、38.0 ℃培養(yǎng)36 h后，取出蓋玻片，瑞特氏染色，顯微鏡下觀察、照相。

1.5 體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞凋亡形態(tài)的電鏡觀察

PBS漂洗收集的卵泡顆粒細(xì)胞，離心成小塊沉淀，用1%瓊脂糖包被沉淀物，迅速加入20倍以上體積的2.5%的戊二醛中固定2 h，制成超薄切片，枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重染色，電鏡(JEM-1200EX，日本)下觀察、拍照。

1.6 顆粒細(xì)胞凋亡和激素分泌的檢測

細(xì)胞培養(yǎng)12 h 后棄去培養(yǎng)液及沒有貼壁的死細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)液漂洗3次，每孔添加 1 mL 無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h后，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)濃度的激素，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取上層培養(yǎng)液，1 000 r·min-1離心10 min去除雜質(zhì)顆粒和聚合物，分別使用雌二醇和孕酮放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)按照試劑盒說明書，測定培養(yǎng)上清液中E2和P的含量。貼壁細(xì)胞用0.25%胰酶和0.02%EDTA溶液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液離心(1 000 r·min-1，5～10 min)，棄上清，加入-20 ℃ 70%的乙醇5 mL固定，-20 ℃冰箱保存，碘化丙啶染色后，流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國Becton Dicknson)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 10.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間比較用方差分析，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征

體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣細(xì)胞生長特性。接種2 h 后，細(xì)胞開始黏附于培養(yǎng)皿底部；6 h 后，可見顆粒細(xì)胞有彼此接近運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，12 h 后，可觀察到顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)聚集生長特性，即較為分散的顆粒細(xì)胞通過自身的運(yùn)動(dòng)聚集成片，尤其在培養(yǎng)皿中部較為明顯；培養(yǎng)24 h 后，顆粒細(xì)胞開始貼壁生長，細(xì)胞呈梭形、放射狀或星形等不規(guī)則多邊形，細(xì)胞之間通過伸出的偽足相互接觸；培養(yǎng) 48 h 后，聚集區(qū)域細(xì)胞間連接緊密，形成“鋪路石”樣單層排布，胞膜邊緣清晰，折光性強(qiáng)；胞質(zhì)的透光性也較好，鏡下可見胞內(nèi)有小顆粒，無空泡現(xiàn)象；72～96 h內(nèi)細(xì)胞可長滿平皿底，形成顆粒細(xì)胞單層(圖1A～C)。定時(shí)取樣，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，牦牛卵泡顆粒細(xì)胞生長曲線呈典型的“S”形(圖1D)。0～2 d是其生長潛伏期，3～6 d 為指數(shù)生長期，7 d 后進(jìn)入停滯期，根據(jù)細(xì)胞生長曲線可知牦牛卵泡顆粒細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為64～72 h(表1)。

2.2 體外培養(yǎng)牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征

在體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞中，筆者觀察到了典型的細(xì)胞凋亡特征。瑞特氏染色，光鏡下觀察，正常顆粒細(xì)胞充分伸展，邊緣不清楚，有大量偽足伸出；胞質(zhì)豐富，呈淡紫色，著色均勻；核大，呈紫色著色均勻，核膜清晰。凋亡顆粒細(xì)胞隨著時(shí)間的延長，呈現(xiàn)出典型的凋亡特征。首先細(xì)胞邊緣收縮而變得清晰，核染色變深，然后核形狀發(fā)生變化，出現(xiàn)啞鈴型、月牙形等不規(guī)則形狀，核染色質(zhì)進(jìn)一步濃縮并邊集化，固有結(jié)構(gòu)逐漸消失；最后，核分裂固縮成團(tuán)，但核膜完整，僅有少量胞質(zhì)包裹其外，并進(jìn)一步裂解為凋亡小體(圖2 a～e)。透射電鏡觀察，可見凋亡的顆粒細(xì)胞染色質(zhì)固縮并凝結(jié)成塊，聚集在核膜周邊呈新月狀或環(huán)狀小體，細(xì)胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松并與胞膜融合，形成一個(gè)個(gè)空泡；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖3A，B)。掃描電鏡可見，凋亡細(xì)胞固縮變小，周圍伸出的偽足減少甚至消失，細(xì)胞表面發(fā)泡，形成許多典型的凋亡小體(圖3C，D)。

表1 不同培養(yǎng)天數(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)

Table 1 The number of follicular granulosa cells counted in every day

時(shí)間/dTime012345678密度/(×104mL-1)Celldensity1.01.21.62.65.610.516.418.217.8

2.3 FSH對牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及E2、P分泌的影響

卵泡顆粒細(xì)胞體外無血清培養(yǎng)體系中，添加0.050～5.000 IU·mL-1的FSH，培養(yǎng)24 h后，分別收集培養(yǎng)上清液和顆粒細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞凋亡和激素含量分析。FCM檢測表明，隨著FSH添加濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸降低，在FSH添加濃度0.500 IU·mL-1時(shí)，凋亡細(xì)胞比例為11.8%，顯著低于對照組的13.9%(P<0.05)，在添加濃度達(dá)到5.00 IU·mL-1時(shí)，凋亡細(xì)胞比例最低降到7.3%，與對照組差異極顯著(P<0.01)。RIA分析培養(yǎng)上清液兩種類固醇激素含量，結(jié)果表明，E2和P水平都隨著添加FSH劑量的增加而呈上升趨勢。其中，E2水平在FSH添加量為0.250 IU·mL-1時(shí)達(dá)到最高(2.94±0.03)pg·mL-1，與對照組(1.49±0.02) pg·mL-1差異極顯著(P<0.01)。P水平在FSH添加量為0.500 IU·mL-1時(shí)達(dá)到最高(1.25±0.03)ng·mL-1，與對照組(0.59±0.03) ng·mL-1差異極顯著(P<0.01)。隨著FSH添加劑量的進(jìn)一步增加，E2和P水平的升高都不明顯(表2)。

2.4 LH對牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及E2、P分泌的影響

FCM檢測表明，在0.050～0.500 IU·mL-1，隨著LH添加濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸降低，在LH添加濃度0.500 IU·mL-1時(shí)，凋亡細(xì)胞比例為10.2%，顯著低于對照組的14.1%(P<0.05)。隨著LH添加濃度的進(jìn)一步增加，凋亡細(xì)胞的比例開始升高，在添加濃度達(dá)到5.000 IU·mL-1時(shí)，凋亡細(xì)胞比例上升到24.2%，與對照組差異極顯著(P<0.01)。RIA分析培養(yǎng)上清液兩種類固醇激素含量，結(jié)果表明，E2和P水平都隨著添加LH劑量的增加而呈上升趨勢。E2水平在LH添加劑量為0.250 IU·mL-1時(shí)達(dá)到(2.01±0.13) pg·mL-1，顯著高于對照組的(1.50±0.02) pg·mL-1(P<0.05)。P水平在FSH添加劑量為0.500 IU·mL-1時(shí)達(dá)到(1.20±0.05) ng·mL-1，極顯著高于對照組的(0.58±0.03) ng·mL-1。隨著LH添加劑量的進(jìn)一步增加，E2和P水平的升高都不明顯(表3)。

A.接種24 h 后，顆粒細(xì)胞呈典型的“星形”；B.接種48 h 后，顆粒細(xì)胞在聚集區(qū)域呈鋪路石樣貼壁生長；C.接種72 h 后，顆粒細(xì)胞鋪滿皿底；D.牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的“S”型生長曲線A.Follicular granulosa cells show a distinctive stellate morphology after planting 24 h，B.Preconfluent monolayer of follicular granulosa cells after planting 48 h；C.Follicular granulosa cells after planting 72 h；D.Growth curves of yak follicular granulosa cells圖1 體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞生長特征Fig.1 The growth characteristics of yak follicular granulosa cells cultured in vitro

a.正常卵泡顆粒細(xì)胞；b.凋亡早期細(xì)胞核濃縮、顏色變深；c.細(xì)胞核邊集化；d.細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)高度濃縮；e.凋亡細(xì)胞裂解成凋亡小體a.Normal granulosa cell；b.Earlier apoptotic granulosa cell with condensed and darkened nuclear；c.Margination of nuclear chromatin；d.Nuclear pyknotic and cytoplasmic dehydration；e.Apoptotic bodies圖2 體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡形態(tài)特征(瑞特氏染色，400×)Fig.2 Morphological characteristics of the apoptotic yak’s granulosa cells cultured in vitro (Wright’s stain，400×)

A、B.透射電鏡觀察，可見細(xì)胞核退形性變化，C、D.掃描電鏡觀察，可見細(xì)胞表面發(fā)泡和凋亡小體的形成A，B.The degradation of nuclear chromatin was observed under transmission electron microscope；C，D.The changes on cell’s surface was observed under scanning electron microscopy圖3 體外培養(yǎng)牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的超微形態(tài)Fig.3 Electron microscopy ultrastructural of the apoptotic yak’s granulosa cells cultured in vitro

表2 FSH對牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和E2、P分泌的影響

Table 2 The effects of FSH to the apoptosis and E2，P secretion of yak granulosa cells culturedinvitro

FSH添加濃度/(IU·mL-1)FSHconcentration重復(fù)次數(shù)Times凋亡比例/%Apoptosisrate雌激素濃度/(pg·mL-1)E2concentration孕酮濃度/(ng·mL-1)Pconcentration5.00057.3±1.3b2.88±0.39b1.20±0.11b2.50059.3±1.4a2.71±0.27b1.09±0.02b0.500511.8±1.6a2.84±0.36b1.25±0.03b0.250513.1±1.72.94±0.03b1.03±0.13a0.125512.9±1.62.45±0.31a0.72±0.130.050513.9±1.51.83±0.130.61±0.10對照組Controlgroup513.9±1.11.49±0.020.59±0.03

a.與對照組差異顯著(P<0.05)；b.與對照組差異極顯著(P<0.01)。下同

a.P<0.05 (vs.control group)；b.P<0.01 (vs.control group).The same as below

表3 LH對牦牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和E2、P分泌的影響

Table 3 The effects of LH to the apoptosis and E2，P Secretion of yak granulosa cells culturedinvitro

LH添加濃度/(IU·mL-1)LHconcentration重復(fù)次數(shù)Times凋亡比例/%Apoptosisrate雌激素濃度/(pg·mL-1)E2concentration孕酮濃度/(ng·mL-1)Pconcentration5.000524.2±3.1b2.36±0.06b1.21±0.00b2.500521.4±2.8b2.04±0.24a1.18±0.12b0.500510.2±1.3a2.01±0.11a1.20±0.05b0.250512.9±1.52.01±0.13a1.10±0.04a0.125513.2±1.71.90±0.201.05±0.05a0.050513.9±1.41.62±0.100.69±0.07對照組Controlgroup514.1±1.21.50±0.020.58±0.03

3 討 論

3.1 卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)為研究顆粒細(xì)胞本身的生物學(xué)特性、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的相互作用提供了理想的模型，也為研究生殖激素對顆粒細(xì)胞生長發(fā)育的影響提供了有利的思路。早在20世紀(jì)70年代初，人們就開始研究大鼠卵泡顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。經(jīng)過不斷改進(jìn)、完善，在包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物上，都已有顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的報(bào)道[7-8]。目前，顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)已成為研究生殖生理和內(nèi)分泌等的重要手段。牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的報(bào)道則鮮見報(bào)道。筆者利用屠宰場廢棄的牦牛卵巢組織，建立了卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，繪制了牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的生長曲線。在此基礎(chǔ)上，觀察牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下發(fā)生細(xì)胞凋亡的顯微和超微結(jié)構(gòu)特征。為進(jìn)一步研究牦牛卵泡顆粒細(xì)胞的生物學(xué)特性和在卵泡發(fā)育過程中的生理作用奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞自主死亡過程，在凋亡啟動(dòng)的不同階段具有不同的生物化學(xué)變化和形態(tài)特征。A.Ali等[9]描述了牛卵巢優(yōu)勢卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡的特征。發(fā)現(xiàn)隨著凋亡的進(jìn)行，顆粒細(xì)胞表現(xiàn)出染色質(zhì)固縮，聚集于核膜下，呈界限分明的顆粒塊狀或新月形小體，細(xì)胞漿濃縮一直到凋亡小體形成等典型特征。J.P.Anchordoquy等[10-11]對體外培養(yǎng)的牛卵泡顆粒細(xì)胞采用地衣紅染色后，觀察到典型的凋亡特征。對體外培養(yǎng)的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞，采用瑞特氏染色后，在顯微鏡下也觀察到核固縮、邊集化、胞質(zhì)濃縮以及凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)，通過電鏡技術(shù)，也進(jìn)一步證實(shí)顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這一結(jié)果表明，瑞特氏染色法操作簡便，可用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡形態(tài)分析。

顆粒細(xì)胞凋亡不僅是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要原因，也與卵母細(xì)胞的成熟及發(fā)育命運(yùn)有關(guān)。E.Host等[12]研究表明顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞核的成熟、受精有關(guān)。R.S.Raman等[13]報(bào)道了卵子的受精能力與卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡狀態(tài)有關(guān)，K.S.Lee等[14]也報(bào)道卵丘顆粒細(xì)胞與患者的年齡、獲卵數(shù)目、受精率及體外受精的結(jié)局有關(guān)，提示卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡狀態(tài)可以預(yù)測體外受精的結(jié)局。然而，E.Warzych等[15]對采用卵丘細(xì)胞凋亡指數(shù)預(yù)測卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的能力提出了質(zhì)疑。有關(guān)顆粒細(xì)胞凋亡在卵母細(xì)胞發(fā)育調(diào)控過程中的作用仍然是值得進(jìn)一步研究的科學(xué)問題。牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)及凋亡檢測體系，為研究牦牛顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟調(diào)控過程中的作用及其機(jī)理提供了一個(gè)平臺(tái)。

3.2 顆粒細(xì)胞凋亡的激素調(diào)控

顆粒細(xì)胞凋亡可由影響卵泡發(fā)育的各種因素和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制引發(fā)，也受旁分泌和自分泌及死亡基因和腫瘤基因之間的相互影響，尤其是FSH和LH可能是決定顆粒細(xì)胞命運(yùn)的主要因素[16]。FSH能夠提高哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞增殖活性。研究表明，F(xiàn)SH可能通過與其受體間的相互作用增加胰島素樣生長因子和類固醇激素水平，從而抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，促使卵泡顆粒細(xì)胞的增殖[17-18]。李鵬飛等[19]在無血清體外培養(yǎng)條件下，研究了促卵泡素FSH和胰島素對綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞增殖和雌激素分泌的影響。發(fā)現(xiàn)FSH與胰島素的共培養(yǎng)體系，顆粒細(xì)胞的增殖和雌激素的分泌量顯著高于單獨(dú)處理組。當(dāng)胰島素濃度為10.0 ng·mL-1，F(xiàn)SH濃度為5.0 ng·mL-1時(shí)，顆粒細(xì)胞的生長狀況最好，培養(yǎng)體系最佳，雌激素分泌量最高。這表明綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞增殖和雌激素分泌需在FSH誘導(dǎo)下進(jìn)行；胰島素對FSH誘導(dǎo)的綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞增殖和雌激素的分泌有促進(jìn)作用。P.Lin等[20]也發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子-1可增強(qiáng)FSH對顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌、孕激素的作用，但其增強(qiáng)作用可被胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)減弱。除蛋白水平調(diào)控外，新近研究表明，F(xiàn)SH可通過調(diào)節(jié)microRNA表達(dá)影響孕激素的合成和顆粒細(xì)胞凋亡[21]。J.M.Silva等[22]研究結(jié)果也證實(shí)，生理濃度的FSH單獨(dú)或聯(lián)合胰島素均可刺激卵丘細(xì)胞分化和促進(jìn)E2的合成能力。但在無血清培養(yǎng)條件下，過高濃度的FSH反而會(huì)降低卵丘細(xì)胞E2的合成能力，且高濃度的FSH還會(huì)產(chǎn)生異相作用，導(dǎo)致卵丘細(xì)胞黃體化[23]。本研究結(jié)果表明，在牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加0.125 IU·mL-1以上的FSH，就可顯著提高顆粒細(xì)胞分泌E2的能力。當(dāng)FSH添加劑量達(dá)到0.500 IU·mL-1時(shí)，顆粒細(xì)胞的凋亡比例也開始顯著下降，分泌的E2和P濃度也極顯著高于對照組。在FSH添加劑量達(dá)到5.000 IU·mL-1時(shí)顆粒細(xì)胞的凋亡比例極顯著低于對照組。這一結(jié)果證實(shí)，在牦牛上FSH同樣可以降低顆粒細(xì)胞凋亡比例，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞分泌類固醇激素能力。

LH是垂體分泌的調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的另一種蛋白質(zhì)激素，它是一種生物大分子，不能透過細(xì)胞膜，必須通過與位于靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，把信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)成熟卵泡排卵，促使卵泡向黃體轉(zhuǎn)化[6]。王偉等[24]研究了LH對體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞生長及類固醇分泌的影響。結(jié)果表明，高劑量的LH (4.0 IU·mL-1)有利于顆粒細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，也能顯著減少顆粒細(xì)胞E2和P4的分泌，并且LH對E2和P4的分泌的調(diào)節(jié)是通過改變這兩種激素合成的關(guān)鍵酶芳香化酶(P450arom)和膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究在牦牛體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞結(jié)果顯示，在0.050～0.500 IU·mL-1，隨著LH添加濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸降低，而E2和P水平則呈上升趨勢。當(dāng)LH濃度達(dá)到5.000 IU·mL-1時(shí)，凋亡細(xì)胞的比例顯著上升，而E2和P水平的升高不明顯。這一結(jié)果表明，LH對牦牛牦牛卵泡顆粒細(xì)胞生長和功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)具有劑量依耐性關(guān)系，低水平的LH可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和功能發(fā)揮，而高劑量的LH則促使顆粒細(xì)胞凋亡。

[1] TSAFRIRI A，BRAW R H.Experimental approaches to atresia in mammals [J].OxfRevReprodBiol，1984，6：226-235.

[2] HIRSHFIELD A N.Development of follicles in the mammalian ovary[J].IntRevCytol，1991，124：43-101.[3] 盧翠玲，楊 巍，胡召元，等.顆粒細(xì)胞的增殖分化及其在卵泡發(fā)育中的作用[J].科學(xué)通報(bào)，2005，50(21)：2341-2347. LU C L，YANG W，HU Z Y，et al.Granular cell proliferation differentiation and its role in follicular development [J].ChineseScienceBulletin，2005，50(21)：2341-2347.(in Chinese)

[4] GLAMOCLIJA V，VILOVIC K，SARAGA-BABIC M，et al.Apoptosis and active caspase-3 expression in human granulosa cells[J].FertilSteril，2005，83(2)：426-431.

[5] GARRETT W M，GUTHRIE H D.Steroidogenic enzyme expression during preovulatory follicle maturation in pigs[J].BiolReprod，1997，56(6)：1424-1431.

[6] PUETT D，ANGELOVA K，COSTA M R，et al.The luteinizing hormone receptor：Insights into structure-function relationships and hormone-receptor-mediated changes in gene expression in ovarian cancer cells[J].MolCellEndocrinol，2010，329(1-2)：47-55.

[7] 王 妍，趙曉娥，楊培先，等.小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2007，35(8)：11-14. WANG Y，ZHAO X E，YANG P X，er al.Culture of mouse granulosa cellsinvitro[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NatureScienceEdition)， 2007，35(8)：11-14.(in Chinese)

[8] 楊永梅，陳 娟，陳 洋，等.哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)研究概況[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(3)：135-138. YANG Y M，CHEN J，CHEN Y，et al.The overview of granulosa cells culture in mammalian follicular[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2011；38(3)：135-138.(in Chinese)

[9] ALI A，LANGE A，GILLES M，et al.Morphological and functional characteristics of the dominant follicle and corpus luteum in cattle and their influence on ovarian function[J].Theriogenology，2001，56(4)：569-576.[10] ANCHORDOQUY J P，ANCHORDOQUY J M，PICCO S J，et al.Influence of manganese on apoptosis and glutathione content of cumulus cells duringinvitromaturation in bovine oocytes [J].CellBiolInt，2014，38(2)：246-253.

[11] IKEDA S，IMAI H，YAMADA M.Apoptosis in cumulus cells duringinvitromaturation of bovine cumulus-enclosed oocytes[J].Reproduction，2003，125(3)：369-376.

[12] HOST E，GABRIELSEN A，LINDENBERG S，et al.Apoptosis in human cumulus cells in relation to zona pellucida thickness variation，maturation stage，and cleavage of the corresponding oocyte after intracytoplasmic sperm injection[J].FertilSteril，2002；77(3)：511-515.

[13] RAMAN R S，CHAN P J，CORSELLI J U，et al.Comet assay of cumulus cell DNA status and the relationship to oocyte fertilization via intracytoplasmic sperm injection[J].HumReprod，2001，16(5)：831-835.[14] LEE K S，JOO B S，NA Y J，et al.Cumulus cells apoptosis as an indicator to predict the quality of oocytes and the outcome of IVF-ET[J].JAssiReprodGene，2001，18(9)：490-498.

[15] WARZYCH E，PERS-KAMCZYC E，KRZYWAK A，et al.Apoptotic index within cumulus cells is a questionable marker of meiotic competence of bovine oocytes maturedinvitro[J].ReprodBiol，2013，13(1)：82-87.[16] HSUEH A J，BILLIG H，TSAFRIRI A.Ovarian follicle atresia：a hormonally controlled apoptotic process[J].EndocrReviews，1994，15(6)：707-724.

[17] YU Y，LI W，HAN Z，et al.The effect of follicle-stimulating hormone on follicular development，granulosa cell apoptosis and steroidogenesis and its mediation by insulin-like growth factor-I in the goat ovary[J].Theriogenology，2003，60(9)：1691-1704.

[18] SEN A，LV L，BELLO N，et al.Cocaine- and amphetamine-regulated transcript accelerates termination of follicle-stimulating hormone-induced extracellularly regulated kinase 1/2 and Akt activation by regulating the expression and degradation of specific mitogen-activated protein kinase phosphatases in bovine granulosa cells[J].MolEndocrinol，2008，22(12)：2655-2676.[19] 李鵬飛，岳文斌，龐鈺瑩，等.FSH和胰島素對綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(9)：1386-1391. LI P F，YUE W B，PANG Y Y，et al.Effects of FSH and insulin on sheep ovarian follicular granulosa cellsinvitroculture[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(9)：1386-1391.(in Chinese)

[20] LIN P，RUI R.Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles [J].MolReprodDev，2010，77(8)：670-678.

[21] YAO N，YANG B Q，LIU Y，et al.Follicle-stimulating hormone regulation of microRNA expression on progesterone production in cultured rat granulosa cells[J].Endocrine，2010，38(2)：158-166.

[22] SILVA J M，PRICE C A.Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cellsinvitro[J].BiolReprod，2000，62(1)：186-191.

[23] SHORES E M，PICTON H M，HUNTER M G.Differential regulation of pig theca cell steroidogenesis by LH，insulin-like growth factor I and granulosa cells in serum-free culture [J].JReprodFertil，2000，118(2)：211-219.

[24] 王 偉，賀 彧，張海燕，等.促黃體素(LH)對豬卵巢顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期及類固醇激素分泌的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27(1)：105-109. WANG W，HE Y，ZHANG H Y，et al.Effects of luteinizing hormone on cell cycle and steroid secretion of porcine granulosa cells[J].JiangsuJournalofAgriculturalSciences，2011，27(1)：105-109.(in Chinese)

(編輯 程金華)

The Effects of FSH，LH on Apoptosis and E2，P Secreting of Yak’s Granulosa Cells Culturedinvitro

XU Geng-quan1，F(xiàn)AN Jiang-feng1，2，YANG Shi-hua1，LI Gu-yue1，ZHAO Hua-shan1，YU Si-jiu1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.TechnologicalResearchCenterofGansuProvinceforEmbryonicEngineeringofBovineandSheep&Goat，Lanzhou730070，China)

This experiment was conducted to study the effect of follicle stimulating hormone(FSH)，luteinizing hormone(LH) on apoptosis and steroids hormone secretion of yak’s granulosa cells culturedinvitro，reveal the mechanism of gonadotropin regulating follicle development.Invitroculture system was established and the growth characteristics，apoptotic morphology were observed using cell culture and micro examination technology.The effect of FSH，LH on apoptosis and estradiol (E2)，progesterone (P) secreting of yak’s granulosa cells culturedinvitrowas analyzed using flow cytometry (FCM) and radioimmunoassay (RIA).The results showed that：Cultured yak’s granulosa cells demonstrated typical epithelioid growth characteristic and had “S” shape growth curve.Occasionally，the apoptotic morphological characteristics such as nuclear pyknotic and margination，endoplasmic reticulum loosen can be found in the cell culture dishes.With the increase of FSH concentration from 0.050 to 5.000 IU·mL-1，the apoptotic rate decreased and the E2，P level be on the rise.When FSH reached 5.000 IU·mL-1，the apoptotic rate down to 7.3% which was very significantly from control group (P<0.01).The apoptosis of granulosa cells were inhibited and the E2，P secreting were prompted when LH was added in a small quantity (0.050-0.500 IU·mL-1)，on the other hand，high concentration of LH(5.000 IU·mL-1) prompted the apoptosis of granulosa cells and inconspicuously effected the E2，P secreting.These results indicated that FSH and LH played an important role in the regulation of follicle development and ovulation through adjust the apoptosis and steroids hormone secretion of granulosa cells in yak.

yak；gonadotropin；granulosa cell；apoptosis；hormone secretion

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.008

2014-10-30

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31272616)；甘肅省青年科技基金計(jì)劃項(xiàng)目(1208RJYA081)

徐庚全(1963-)，男，甘肅武威人，研究員，博士，主要從事畜禽疾病診斷與防治研究，E-mail: xugq@gsau.edu.cn

*通信作者：余四九，教授， E-mail: yusj@gsau.edu.cn

S823.8+5；S814

A

0366-6964(2015)06-0932-08