神經(jīng)肽B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫熒光表達(dá)

郁阿翠 黃俊山 曾雪愛

·基礎(chǔ)研究·

神經(jīng)肽B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫熒光表達(dá)

郁阿翠 黃俊山 曾雪愛

目的 研究神經(jīng)肽B(NPB)在大鼠腦組織中的定位，探討NPB與睡眠的關(guān)系。方法 采用免疫熒光法測定NPB在除嗅球、垂體及小腦以外大鼠腦組織中的表達(dá)。結(jié)果及結(jié)論 NPB不僅表達(dá)于于下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、弓狀核、視交叉上核和未定帶腹側(cè)區(qū)及中腦的腹側(cè)被蓋區(qū)，中縫背核，黑質(zhì)等區(qū)域，還見于基底前腦的VDB和HDB；內(nèi)、外側(cè)蒼白球，尾狀核；丘腦網(wǎng)狀核；腦干的中縫隱核、中縫核、前被蓋核、橫紋肌核、旁正中網(wǎng)狀核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核。

神經(jīng)肽B；免疫熒光；腦立體定位

神經(jīng)肽B(NPB)是2002年Fuji等[1]從牛的下丘腦中提取鑒定出來的G蛋白耦合受體7(GPR7)和G-蛋白耦合受體8(GPR8)的內(nèi)源性配體，NPB及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織均有廣泛存在，參與調(diào)節(jié)了攝食和能量平衡、神經(jīng)內(nèi)分泌及炎性反應(yīng)疼痛，近年還發(fā)現(xiàn)其參與了睡眠與應(yīng)激情緒和行為的調(diào)節(jié)。功能與組織分布具有密切的關(guān)系。為了更深入的研究NPB與睡眠的關(guān)系，本文通過免疫熒光測定了除嗅球、垂體及小腦以外的大鼠腦連續(xù)切片，發(fā)現(xiàn)NPB陽性細(xì)胞不僅存在于下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、弓狀核、視交叉上核和未定帶腹側(cè)區(qū)[2-3]及中腦的腹側(cè)被蓋區(qū)，中縫背核，黑質(zhì)等區(qū)域[3]，還見于基底前腦的VDB和HDB；內(nèi)、外側(cè)蒼白球，尾狀核；丘腦網(wǎng)狀核；腦干的中縫核、中縫隱核、前被蓋核、橫紋肌核、正中網(wǎng)狀核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核。為進(jìn)一步研究NPB與睡眠的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6只SD雄性大鼠，體重220～250 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[實驗動物許可證號SCXK(閩)2012-0001]。

1.2 設(shè)備及試劑 冰凍切片機(CMl900，Leica)；熒光倒置相差顯微鏡(DMI3000，Leica)；-20 ℃冰箱(伊萊克斯，型號BCD-182K)；Neuropeptide B Antibodies(Pierce Biotechnology公司)；Alexa Fluor@488標(biāo)記山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；10%正常羊封閉血清(福州碩博生物技術(shù)有限公司)，免疫熒光染色二抗稀釋液(碧云天生物技)；抗熒光淬滅封片液(強，碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)本處理 實驗大鼠經(jīng)10%水合氯醛按0.3 mL/100 mg麻醉后迅速開胸，先使用200 mL 0.1 mol/L PBS溶液從主動脈灌流，后采用4 ℃的4%多聚甲醛先快后慢外固定。冰上迅速分離腦后，置于4%多聚甲醛過夜，然后移至30%蔗糖溶液中脫水。等組織沉底后，在液氮中速凍1 min，利用冰凍切片機切片，30 μm/片，收集切片到凍存液中備用。

1.3.2 NPB免疫熒光染色 將組織切片從凍存液中取出放入12孔板孔中，用0.01 PBS磷酸鹽緩沖液洗5遍，每次10 min；10%正常羊封閉血清37 ℃封閉90 min；NPB抗體(1∶500)，4 ℃孵育48 h后用0.01PBS磷酸鹽緩沖液洗5遍，每次10 min；Alexa Fluor@488標(biāo)記山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈，1∶200)孵育2 h；0.01PBS磷酸鹽緩沖液洗5遍，每次10 min；DAPI染色液常溫染色5 min，0.01PBS磷酸鹽緩沖液洗3遍，每次5 min；將組織切片轉(zhuǎn)移到載玻片上用抗熒光淬滅封片液(強)封片，倒置熒光顯微鏡下拍片。以上3個步驟注意避光。

圖像采集使用DMI3000，Leica的熒光倒置相差顯微鏡，參考腦立體定向圖譜(Paxinos和Watson)分析單側(cè)神經(jīng)核團(tuán)從腹側(cè)向背側(cè)的所有陽性神經(jīng)元表達(dá)分布情況。

2 NPB陽性細(xì)胞在大鼠腦組織中分布

2.1 基底前腦 NPB陽性細(xì)胞在基底前腦斜角帶水平支臂核(HDB)和斜角帶垂直支臂核(VDB)的分布，見圖1A-B。

圖1 NPB陽性細(xì)胞在基底前腦的分布

注：A、NPB陽性細(xì)胞在基底前腦斜角帶水平支臂核(HDB)的分布。B、NPB陽性細(xì)胞在基底前腦斜角帶垂直支臂核(VDB)的分布。

2.2 蒼白球及其附近組織 NPB陽性細(xì)胞在內(nèi)外側(cè)蒼白球有中等數(shù)量分布，而在其附近的丘腦網(wǎng)狀核(Rt)及下丘腦未定帶區(qū)(ZI)有相對更多數(shù)量的分布，見圖2 A-B。

圖2 NPB陽性細(xì)胞在蒼白球及其附近組織的分布

注：(A)中等數(shù)量的NPB陽性細(xì)胞存在于外側(cè)蒼白球(LGP)。(B)在內(nèi)側(cè)蒼白球(MGP)也有數(shù)量較多的NPB陽性細(xì)胞存在，但在丘腦網(wǎng)狀核(Rt)和下丘腦未定帶區(qū)(ZI)觀察到更多數(shù)量。

2.3 下丘腦 NPB陽性細(xì)胞在下丘腦多個部位均有存在，如下丘腦外側(cè)區(qū)(LH)，弓狀核(Arc)(圖3A、D)，未定帶區(qū)(ZI)(圖2B)均可見中等數(shù)量的NPB免疫陽性細(xì)胞。更有大量的NPB陽性細(xì)胞存在下丘腦室旁核(PaLM、PaMP)和視上核(SO)，而在下丘腦視周核(Pe)僅有零星分布(圖3B、C)。在正中隆起的內(nèi)外層(MEE、MEI)也有NPB陽性細(xì)胞的分布，見圖3D。

圖3 NPB陽性細(xì)胞在下丘腦的分布

注：(A)中等數(shù)量的NPB陽性細(xì)胞存在于下丘腦外側(cè)區(qū)(LH)。(B)在下丘腦室旁核(PaLM、PaMP)有數(shù)量較多的NPB陽性細(xì)胞存在，而在下丘腦視周核(Pe)僅有離散分布。(C)NPB陽性細(xì)胞在視上核(SO)的分布。(D)NPB陽性細(xì)胞在弓狀核(Arc)及正中隆起的內(nèi)外層(MEE、MEI)分布，細(xì)胞形態(tài)較視上核及視旁核的細(xì)胞小。

2.4 腦干 實驗發(fā)現(xiàn)，NPB陽性細(xì)胞不僅見于中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)、中縫背核(DR)、黑質(zhì)(SN)及埃-韋斯特法爾核(EW核)，見圖4A-D。在腦干其他部位，也存在NPB陽性細(xì)胞，如腦干的中縫正中核(MnR)、中縫旁正中核(PMnR)、中縫隱核(Rob)、腦橋網(wǎng)狀核嘴側(cè)部(PnO)、前被蓋核(Atg)、橫紋肌核(Rbd)、旁正中網(wǎng)狀核(PMn)、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(Gi)，見圖4E-I。另外，在藍(lán)斑(LC)大細(xì)胞中也有NPB蛋白的表達(dá)，見圖5。

3 討論

已有多項研究證明具有調(diào)節(jié)能量代謝和內(nèi)分泌功能的神經(jīng)肽一般也具有調(diào)節(jié)睡眠的作用，如食欲肽[4-5]、神經(jīng)肽S[6-7]、神經(jīng)肽Y[8]等。2011年Hirashima等[9]在光、暗兩個時相分別給側(cè)腦室注射NPB，發(fā)現(xiàn)在暗時相NPB減少了小鼠自發(fā)活動，腦電及肌電測定也顯示在該時相NPB，增加慢波睡眠(SWS)，而異相睡眠并未受影響，并且NPB誘導(dǎo)的慢波睡眠的光譜功率與生理性的。但是NPB通過何種途徑調(diào)節(jié)睡眠還不是很清楚。結(jié)構(gòu)和功能是密切相關(guān)的，本實驗發(fā)現(xiàn)NPB免疫陽性細(xì)胞在下丘腦、腦干及基底前腦的多個核團(tuán)均有表達(dá)。

圖4 NPB陽性細(xì)胞在腦干的分布

注：(A)NPB陽性細(xì)胞在埃-韋斯特法爾核(EW核)的分布。(B)在維管束間核(IF)未見明顯NPB免疫陽性細(xì)胞存在，在腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)及PN核有少量NPB陽性細(xì)胞分布。(C)在黑質(zhì)(SN)，NPB陽性細(xì)胞主要分布在黑質(zhì)背層(SNCD)及黑質(zhì)內(nèi)側(cè)部(SNM)，在黑質(zhì)網(wǎng)狀部(SNR)及黑質(zhì)外側(cè)部(SNL)也有分布。(D)NPB陽性細(xì)胞在中縫背核(DR)、中縫正中核(MnR)、中縫旁正中核(PMnR)、前被蓋核(Atg)、橫紋肌核(Rbd)的分布。(E)NPB陽性細(xì)胞中縫正中核(MnR)、中縫旁正中核(PMnR)的分布。(F)NPB陽性細(xì)胞在腦橋網(wǎng)狀核嘴側(cè)部(PnO)的離散分布。(G)NPB陽性細(xì)胞在中縫隱核(Rob)、旁正中網(wǎng)狀核(PMn)、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(Gi)的分布。(H)及(I)顯示高倍鏡下NPB免疫陽性細(xì)胞在中縫隱核(Rob)、旁正中網(wǎng)狀核(PMn)、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(Gi)的分布。

圖5 NPB陽性細(xì)胞在藍(lán)斑的分布，其細(xì)胞形態(tài)多呈紡錘形

覺醒依賴于腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)的激活，該系統(tǒng)經(jīng)中腦分為兩支，一支經(jīng)過丘腦，另一支經(jīng)下丘腦外側(cè)區(qū)和基底前腦到達(dá)皮層，研究發(fā)現(xiàn)腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)-丘腦-皮層通路在覺醒維持中的作用較小，主要是腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)-下丘腦外側(cè)區(qū)和基底前腦-皮層發(fā)揮作用[10]。NPB在網(wǎng)狀核的分布提示其是腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的組成部分，另外其在下丘腦、基底前腦的分布，提示可能參與腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，在以后的實驗中可以通過局部注射NPB或是其激動劑、抑制劑，再通過神經(jīng)束路示蹤技術(shù)觀察NPB的神經(jīng)傳導(dǎo)通路，另外還可以通過腦電、肌電觀察判斷這些核團(tuán)中的NPB對睡眠的具體影響。研究發(fā)現(xiàn)在中腦的腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)，黑質(zhì)(SN)區(qū)均有NPB陽性細(xì)胞存在，且與酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元(可能為多巴胺能神經(jīng)元)共表達(dá)[11]。研究表明酪氨酸羥化酶和食欲素受體在VTA廣泛共表達(dá)[12]。那么在中腦，NPB是否與食欲素受體有直接的聯(lián)系，這種假設(shè)還有待進(jìn)一步的研究證實。

慢性睡眠剝奪作為一個應(yīng)激源可激活HPA軸[13-14]，研究發(fā)現(xiàn)慢性睡眠剝奪會導(dǎo)致肥胖的發(fā)生，可能的方式是通過增加攝食，降低基礎(chǔ)代謝率及增加胰島素抵抗等[15]。NPB具有調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)皮質(zhì)軸的作用[16]，同時還可增加抵抗素的分泌和表達(dá)[17]。下丘腦外側(cè)區(qū)被稱為“攝食中樞”，損毀或者高頻電刺激該區(qū)均可以減少食物的攝取致體重的下降[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)NPB在下丘腦外側(cè)區(qū)的分布，提示其可能與慢性睡眠剝奪后的能量調(diào)控有關(guān)。

睡眠剝奪常伴發(fā)情緒障礙，如焦慮、緊張、易怒[19]，中縫核是5-HT能神經(jīng)元的密集區(qū)，具有調(diào)節(jié)情緒、壓力及協(xié)調(diào)社會關(guān)系的作用，NPB在中縫背核，中縫隱核、中縫核的分布提示其可能參與睡眠障礙伴發(fā)的情緒障礙的發(fā)生及發(fā)展。

目前關(guān)于NPB在睡眠中的研究還較少，其在睡眠調(diào)控區(qū)域的廣泛分布預(yù)示著其可能參與睡眠調(diào)節(jié)的多個過程，加深對NPB在睡眠調(diào)控中的認(rèn)識，有助于為深入研究機體對睡眠與覺醒的調(diào)節(jié)機制尋找一個切入點。

[1]Fuji R,YoshidaH，F(xiàn)ukusumi S，et al.Identication of a neuropeptide modied with bromine as an endogenous ligand for GPR7[J].J Biol Chem，2002，277：34010-34016.

[2]Schulz S,Stumm R,Hollt V.Immunofluorescent identification of neuropeptide B-containing nerve fibers and terminals in the rat hypothalamus[J].Neurosci Lett，2007，411(1):67-71.

[3]Dun SL,Brailoiu GC,Mizuo K，et al.Neuropeptide B immunoreactivity in the central nervous system of the rat[J].Brain Res，2005，1045(1-2):157-163.

[4]Sakurai T.Orexin deficiency and narcolepsy[J].Curr Opin Neurobiol，2013，23(5):760-766.

[5]Sakurai T,Mieda M.Connectomics of orexin-producing neurons：interface of systems of emotion，energy homeostasis and arousal[J].Trends Pharmacol Sci，2011，32(8):451-462.

[6]Zhao P,Shao YF,Zhang M,et al.Neuropeptide S promotes wakefulness through activation of the posterior hypothalamic histaminergic and orexinergic neurons[J].Neuroscience，2012，207：218-226.

[7]Ahnaou A,Drinkenburg WH.Neuropeptide-S evoked arousal with electroencephalogram slow-wave compensatory drive in rats[J].Neuropsychobiology，2012，65(4):195-205.

[8]Dyzma M,Boudjeltia KZ,Faraut B,et al.Neuropeptide Y and sleep[J].Sleep Med Rev，2010，14(3):161-5.[9]Hirashima N，Tsunematsu T，Ichiki K，et al.Neuropeptide B induces slow wave sleep in mice[J].Sleep，2011，34(1):31-37.

[10]Fuller PM,Sherman D,Pedersen NP，et al.Reassessment of the structural basis of the ascending arousal system[J].J Comp Neurol，2011，519(5):933-956.

[11]Dun SL,Brailoiu GC,Mizuo K，et al.Neuropeptide B immunoreactivity in the central nervous system of the rat[J].Brain Res,2005,1045(1-2):157-163.

[12]Narita M,Nagumo Y,Hashimoto S，et al.Direct involvement of orexinergic systems in the activation of the mesolimbic dopamine pathway and related behaviors induced by morphine[J].J Neurosci,2006,26(2):398-405.

[13]van Liempt S,Arends J,Cluitmans PJ，et al.Sympathetic activity and hypothalamo-pituitary-adrenal axis activity during sleep in post-traumatic stress disorder:a study assessing polysomnography with simultaneous blood sampling[J].Psychoneuroendocrinology,2013,38(1):155-165.

[14]Galvao Mde O,Sinigaglia-Coimbra R,Kawakami SE，et al.Paradoxical sleep deprivation activates hypothalamic nuclei that regulate food intake and stress response[J].Psychoneuroendocrinology,2009,34(8):1176-1183.

[15]Lucassen E A,Rother K I,Cizza G.Interacting epidemics? Sleep curtailment，insulin resistance，and obesity[J].Ann N Y Acad Sci，2012,1264(1):110-134.

[16]Mogi K,Ito S,Matsuyama S，et al.Central administration of neuropeptide B，but not prolactin-releasing peptide，stimulates cortisol secretion in sheep[J].J Reprod Dev,2008,54(2):138-141.

[17]Skrzypski M,Pruszynska-Oszmalek E,Rucinski M,et al.Neuropeptide B and W regulate leptin and resistin secretion，and stimulate lipolysis in isolated rat adipocytes[J].Regul Pept，2012,176(1-3):51-56.

[18]Harrell LE，Decastro JM，Balagura S：A critical evaluation of body weight loss following lateral hypothalamic lesions[J].Physiol Behav,1975，15(1):133-136.

[19]Oginska H,Pokorski J.Fatigue and mood correlates of sleep length in three age-social groups：School children，students，and employees[J].Chronobiol Int,2006,23(6):1317-1328.

Neuropeptide B immunofluorescence in the central nervous system of the rat

YU Acui, HUANG Junshan, ZENG Xueai.

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003,China

Objective To study the expression of NPB in the rat brain,in order to further research the relationship between NPB and sleep.Methods With the use of an antiserum directed against the rat NPB, immunofluorescence to NPB was detected in several discrete areas of the central nervous system except the olfactory bulb,pituitary and cerebellum of serial section in this article.Results & Conclusion I found that NPB immune positive (irNPB) cells not only prenst in the hypothalamic (ventromedial nucleus, dorsal medial nucleus), arcuate hypothalamic nucleus,supraoptic nucleus and zona incerta, The ventral tegmental area, dorsal raphe nucleus, substantia nigra and so on of the midbrain , they also were found in the basal forebrain (VDB and HDB), globus pallidus(lateral,medial), caudate putamen (striatum), reticular thalamic nucleus, median raphe nucleus, raphe obscurus nucleus, anterior tegmental nucleus, rhabdoid nucleus, paramedian reticular nucleus and gigantocellular reticular nucleus.

Neuropeptide B; G-protein coupled receptors; Sleep; Stress

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81173149，81202845)；福建省中醫(yī)藥研究院自主選題項目(編號：2013fjzyyk-1)

350003福州，福建省中醫(yī)藥研究院

黃俊山，E-mail：hjsh0825@163.com