川穹嗪注射液對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用觀察

李 甲，徐凌忠

酒精性肝病是指長期大量飲酒或含有乙醇的飲料所致的肝臟疾病，包括輕癥脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化、肝癌［1］。隨著生活方式的改變及公共關(guān)系來往的密切，人們飲酒的機(jī)會增加。近年來我國酒精性肝損傷的發(fā)病率逐年增加，引發(fā)社會和醫(yī)學(xué)界的重視。該病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚不完全清楚，可能與乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒性作用及氧化應(yīng)激等多種因素有關(guān)［2］。川穹嗪，又名四甲基吡嗪，是從傘形科藁本屬植物川穹中分離提純的生物堿單體，是中藥川穹的主要有效成分，是活血行氣祛淤的一種中藥活性生物堿，目前廣泛應(yīng)用于臨床，具有抗血小板聚集，改善微循環(huán)，增加腦血流和活血化淤作用［3］。近來，研究表明川芎嗪能清除氧自由基，減少其毒性，具有良好的抑制脂質(zhì)過氧化作用［4］，但至今未見川穹嗪對急性酒精性肝損傷的作用報(bào)道。本文通過觀察川穹嗪注射液對急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，初步探討其保肝機(jī)制，為臨床用藥提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:昆明小白鼠，雄性，18～22 g。安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證書號:SCXK(皖)2011－002。在溫度20℃～24℃，濕度50%～60%的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。普通飼料喂養(yǎng)，不限攝水。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 川穹嗪注射液(北京第四制藥廠)實(shí)驗(yàn)時用0.9%生理鹽水配制;甘利欣注射液(正大天晴制藥有限公司)實(shí)驗(yàn)時用0.9%生理鹽水配制;無水乙醇(北京化工廠)。谷光甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。DK-8A 電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，ESJ110-4B 電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司)，Infinite M200TECAN 酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 集團(tuán)公司)全自動生化分析儀(日本日立公司，型號7600-020)，離心機(jī)(安徽嘉文，型號:JW3021HR)。

1.2.2 小鼠急性酒精性肝損傷模型的建立及給藥方法 雄性昆明小鼠60 只，隨機(jī)分為正常組、模型組、甘利欣注射液陽性藥對照組、川穹嗪注射液高、中、低量組，每組10 只。造模方法:除正常組蒸餾水灌胃外，其余各組均于每日上午用50%的酒精按50%酒精12 ml/kg 灌胃1 次，連續(xù)15 d。同時，每日下午治療組小鼠每日分別按川穹嗪注射液高劑量(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(200 mg/kg)，正常對照組(生理鹽水20 ml/kg)，模型組(生理鹽水20 m l/kg)，陽性藥對照組(甘利欣22.5 mg/kg)均每日腹腔注射給藥，連續(xù)15 d。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 生化指標(biāo)檢測 末次給藥后，禁食不禁水24 h，斷頭取血，快速離心后送至蚌埠三院檢驗(yàn)科，檢測血清中ALT、AST含量。

1.3.2 肝組織勻漿中的丙二醛、谷胱甘肽含量測定 剖腹摘取肝組織，生理鹽水反復(fù)清洗，吸水紙吸干，取肝右葉0.2 g 左右，減碎后加入9 倍的0.9%生理鹽水，根據(jù)試劑盒說明書要求制備10%的肝勻漿，檢測肝勻漿中MDA、GSH 的含量。

1.3.3 肝臟組織病理形態(tài)學(xué)檢查 取肝臟左葉，放入10%的甲醛中固定，經(jīng)過脫水、透明、蘇木素-伊紅(Hematoxylin－Eosin)染色，在光鏡下觀察肝臟病理變化

2 結(jié)果

2.1 急性酒精性肝損傷小鼠的一般情況觀察 與正常對照組比較，模型組小鼠體重減輕，皮毛無光澤，飲食減少，四肢癱軟無力，精神差，造模第3～4 d 出現(xiàn)稀便。除正常組外，其余各組都出現(xiàn)小鼠死亡，模型組最為嚴(yán)重，數(shù)量為3 只。川穹嗪注射液低、中劑量組各死亡1 只，小鼠飲食，醉酒，二便情況較模型組有不同程度地改善。

2.2 川穹嗪注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝功能指標(biāo)的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清ALT、AST 活性明顯升高(P＜0.01)，表明成功制備小鼠急性肝損傷模型。甘利欣陽性藥組及川穹嗪注射液三個劑量組能明顯降低模型小鼠血清的ALT、AST 含量(P＜0.01)。且川穹嗪注射液作用呈劑量依賴性，見表1。

表1 川穹嗪注射液對酒精性肝損傷小鼠肝功能指標(biāo)的影響(n=10，±s)

表1 川穹嗪注射液對酒精性肝損傷小鼠肝功能指標(biāo)的影響(n=10，±s)

注:與正常組比較，#P＜0.05;與模型組比較* P＜0.05。

組別ALT(U/L)AST(U/L)正常組33.3 ±12.3645.3 ±9.88模型組175.2 ±25.78#226.9 ±28.62#甘利欣注射液組48.1 ±9.49*47.4 ±8.71*川穹嗪注射液組:高劑量組87.3 ±17.8*90.7 ±7.93*中劑量組100.3 ±19.93*126.9 ±14.72*低劑量組128.3 ±19.44*187.7 ±22.41*

2.3 川穹嗪注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中GSH和MDA 含量的影響 與正常對照組對比，模型組小鼠肝組織中MDA 水平顯著上升(P＜0.01)，GSH 含量明顯下降(P＜0.01)。與模型組比較，甘利欣注射液陽性對照組和川穹嗪注射液的3 個劑量組的MDA 含量明顯減低(P＜0.01)，甘利欣注射液陽性對照組以及川穹嗪注射液的3 個劑量組肝勻漿GSH 含量明顯增加(P＜0.01)。表明川穹嗪注射液對急性酒精肝損傷小鼠的保護(hù)作用與其提高體內(nèi)抗氧化活性有關(guān)。見表2。

表2 川穹嗪注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中MDA 和GSH 含量的影響(n=10，±s)

表2 川穹嗪注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中MDA 和GSH 含量的影響(n=10，±s)

注:與正常組比較#P ＜0．05;與模型組比較* P ＜0．05。

組別MDA(nmol/mgprot)GSH(mg/gprot)正常組5．49 ±1．466．21 ±2．13模型組15．72 ±3．75#2．37 ±0．51#甘利欣注射液組6．51 ±2．38*6．06 ±2．25*川穹嗪注射液組:高劑量組6．82 ±2．29*5．28 ±0．99*中劑量組9．95 ±3．07*4．41 ±1．38*低劑量組11．63 ±5．41*3．84 ±1．41*

圖1 HE 染色檢測各組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化(×400)

2.4 川穹嗪注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)變化的影響 正常組肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈為中心向四周放射狀排列，細(xì)胞細(xì)胞核圓形或橢圓形，無碎裂、居中，胞質(zhì)豐滿，包膜完整。模型對照組小鼠肝組織損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，大量肝細(xì)胞脹明顯，中央靜脈周圍肝細(xì)胞可見點(diǎn)狀或灶樣壞死，細(xì)胞核被擠向一邊，胞漿出現(xiàn)大小不一的脂肪空泡，呈氣球樣變，并伴有炎性細(xì)胞浸潤。陽性對照藥組和川穹嗪射液3 個劑量組的肝細(xì)胞腫脹程度、脂質(zhì)沉積及脂肪變性、炎性浸潤程度得以不同程度緩解。其中川穹嗪注射液高劑量組效果最好，包膜完整，結(jié)構(gòu)清晰。川穹嗪注射液具有改善肝細(xì)胞病理損傷的功效。見圖1。

3 討論

酒精的致病因素單一，但目前其發(fā)病機(jī)制尚未能明確，近來發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與酒精性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。酒精作為一種強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激原和高滲透性的小分子有機(jī)物，在代謝過程中可誘生出大量的自由基，是造成多器官、多系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制之一［5］。在體內(nèi)積累過多的自由基和活性氧自由基簇(ROS)會對細(xì)胞產(chǎn)生高度毒性。

正常情況下，ALT 和AST 只存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受損壞死后，ALT、AST 釋放入血，導(dǎo)致血清中ALT、AST 升高，因此轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損傷的最敏感指標(biāo)［6］。MDA 是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物的一種，其水平高低可以間接地反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度。GSH 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其含量大小反映了機(jī)體清除氧自由基的能力［7］。川穹是我國傳統(tǒng)中藥，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，該藥可顯著降低老齡大鼠腦、心、肝中過氧化脂質(zhì)含量.并能提高腦、肝中單胺氧化酶和超氧化物歧化酶活力。為探討川穹嗪注射液的保肝及其、機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用了血清中ALT、AST，肝組織中MDA 和GSH 以及肺組織病理切片這幾個有代表性的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)川穹嗪注射液能夠降低酒精小鼠ALT、AST 的含量，能夠明顯降低酒精導(dǎo)致的GSH耗竭，抑制肝臟MDA 的生成。通過病理觀察，經(jīng)川穹嗪注射液的治療，小鼠肝組織的水腫、脂肪病變、壞死等損傷有不同程度地改善，發(fā)揮一定的保肝作用。

總之，川川穹嗪注射液能夠降低轉(zhuǎn)氨酶，提高肝組織GSH 活性，減少M(fèi)DA 的產(chǎn)生。一定程度清除自由基、抑制氧化應(yīng)激，從而對急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

［1］朱慧艷，李婷冶，陳 潔.酒精性肝病的診斷和治療進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2014，20(14):2556-2559.

［2］王畢娟，王 沁，張志強(qiáng)，等.酒精性肝病患者淋巴細(xì)胞染色體損傷與氧化應(yīng)激關(guān)系［J］.世界華人雜志，2010，18(4):388-391.

［3］饒麗華，趙詩云，尹小明.川芎嗪抗血小板聚集的實(shí)驗(yàn)研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，29(9):976-977.

［4］錢 超.川芎嗪對心血管的藥理作用［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)院，2014，23(10):107-108.

［5］何 寧，張靜姝，張 靜，等.乙醇誘導(dǎo)小鼠急性肝細(xì)胞損傷模型中NF-κB 的表達(dá)［J］.癌變·畸變·突變，2014，26(1):52-55.

［6］俸家福，涂植光.肝功能相關(guān)的血清酶學(xué)研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(3):225-230.

［7］韓 玲，陳克冀.川芎嗪對缺血再灌注心肌保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，18(1):41-43.

［8］粟 坤，郭忠興，郭朝陽.川芎嗪對老齡大鼠腦、心、肝臟過氧化脂質(zhì)含量的影響［J］.佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，1(1):11-12.