都勻毛尖對小鼠肝臟CYP3A酶活性及其mRNA水平的影響*

王筑婷， 李紅梅， 雷霆雯

(貴陽醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

?

都勻毛尖對小鼠肝臟CYP3A酶活性及其mRNA水平的影響*

王筑婷， 李紅梅， 雷霆雯**

(貴陽醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

目的： 研究綠茶對細(xì)胞色素P450 3A(CYP3A)酶活性及其mRNA水平的影響，推測綠茶對藥物代謝的作用。方法： 綠茶選用都勻毛尖，120只昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為4組，對照組正常飲食飲水，低、中、高劑量綠茶組分別予0.25 g/(kg·d)、0.5 g/(kg·d)、1.0 g/(kg·d)都勻毛尖茶湯灌胃，分別在1周、2周、3周時(shí)處死小鼠，測定小鼠肝臟微粒體CYP3A的活性，并用RT-PCR技術(shù)檢測小鼠肝臟中CYP3A11 mRNA水平。結(jié)果： 都勻毛尖能抑制CYP3A酶活性，呈時(shí)間-劑量依賴性；都勻毛尖可抑制CYP3A11mRNA表達(dá)，且呈時(shí)間-劑量依賴性。結(jié)論： 都勻毛尖對CYP3A的酶活性及mRNA水平均呈時(shí)間-劑量依賴性抑制作用，提示都勻毛尖可能通過影響CYP3A酶活性對藥物的代謝發(fā)揮作用。

綠茶；細(xì)胞色素P450；酶活性；代謝解毒，藥物

細(xì)胞色素P450酶是細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)基因超家族編碼形成的一組酶蛋白[1]，哺乳動(dòng)物CYP450可分為3類，其中微粒體CYP450是主要的一類，由多個(gè)基因家族組成(CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP17、CYP19、CYP21)。CYP3A是CYP450酶系中最主要的一類，近一半藥物都經(jīng)過CYP3A代謝，CYP3A一方面能催化藥物發(fā)揮藥效，另一方面加速藥物清除[2]。因此CYP3A的活性可用于研究藥動(dòng)學(xué)、藥物或毒物的代謝、藥物相互作用、藥物代謝酶的遺傳多態(tài)性及疾病與代謝酶的相互影響。茶葉原產(chǎn)于中國，我國的產(chǎn)茶區(qū)遍及全國19個(gè)省區(qū)、1 000余個(gè)縣市，全世界有160多個(gè)國家都在飲茶[3]。作為保健品，綠茶較多地保留了鮮葉內(nèi)的天然物質(zhì)[4]，對其研究多集中于提取物兒茶素或茶多酚，綠茶對CYP3A的酶活性有何影響尚未見報(bào)道。本研究觀察都勻毛尖的茶湯對CYP3A酶活性及mRNA表達(dá)的影響，以了解其對藥物代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

都勻毛尖(散裝，購于都勻毛尖茶直銷專賣店)。昆明種雄性小鼠(貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)，體質(zhì)量(30±3)g。Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)、氨基比林、NADP+、6-磷酸葡萄糖二鈉、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、焦碳酸二乙酯 (DEPC)、Trizol、氯仿/異戊醇(24∶1)、異丙醇、PCR擴(kuò)增試劑、瓊脂糖(均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒、DNAGREEN綠如藍(lán)低毒核酸染料(均購于北京天恩澤基因科技有限公司)、DNA Marker (FERMENTAS公司)、RT-PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，CYP3A11引物：上游為5′-TGACAAACAAGCAGGGAT-3′，下游為5′-CTGGTGAATGTGGGGGAC-3′、β-Actin引物：上游為5′-TGCGTTTTACACCCTTTC-3′，下游為5′-AGTCCTCAGCCACATTTG-3′。

1.2 方法

1.2.1 綠茶的制備 分別將1.5 g、3 g、6 g 綠茶加入100 mL沸水中，浸泡30 min，用兩層紗布過濾，即得低劑量組(0.25 g/kg)、中劑量組(0.5 g/kg)及高劑量組(1 g/kg)茶湯，灌胃準(zhǔn)備[5]，所用茶湯均每日現(xiàn)配。1.2.2 動(dòng)物分組 雄性昆明種小鼠120只，隨機(jī)分為1個(gè)對照組及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組30只。實(shí)驗(yàn)組分為低劑量組(0.25 g/kg)、中劑量組(0.5 g/kg)及高劑量組(1 g/kg)，對照組正常飲食飲水，各實(shí)驗(yàn)組每日給予各自濃度茶湯灌胃后正常飲食飲水，灌胃量為0.5 mL，每日灌胃一次，連續(xù)灌胃1周、2周、3周后每組各處死動(dòng)物10只。

1.2.3 制備微粒體 鈣沉淀法制備微粒體懸液，按照文獻(xiàn)[6] 操作。肝微粒體蛋白質(zhì)濃度測定用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，按照說明書操作。

1.2.4 CYP3A酶活性的測定 通過測定紅霉素N-脫甲基酶活性反映CYP3A酶活性,具體操作按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.2.5 CYP3A11基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 肝組織總RNA的提取，按Trizol試劑說明書提取肝組織總RNA，沉淀用RNase-free H2O溶解，測定260 nm和280 nm時(shí)的 OD值，判斷RNA的純度，計(jì)算RNA濃度，按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA[8]。PCR擴(kuò)增體系總體積25 μL，預(yù)變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火51 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，終末延伸72 ℃ 7 min，30個(gè)循環(huán)[9]。制2%瓊脂糖凝膠，每100 mL凝膠加8 μL DNAGREEN， 0.5×TBE電泳緩沖液、100 V電壓電泳50 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，在凝膠成相分析系統(tǒng)上照相觀察結(jié)果并記錄，計(jì)算CYP3A11基因與β-Actin基因擴(kuò)增條帶表達(dá)量像素灰度的比值作為mRNA表達(dá)的相對水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CYP3A酶活性

隨著綠茶作用時(shí)間的延長和劑量的增大， CYP3A的酶活性逐漸降低。各組比較后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。見圖1、表1。

圖1 都勻毛尖對各組小鼠肝微粒體CYP3A酶活性的影響Fig.1 Effect of Duyun Mao Jian Tea on enzymatic activity of CYP3A of mice liver microsome

表1 都勻毛尖灌胃不同時(shí)間對小鼠肝微粒體CYP3A酶活性的影響Tab.1 Effect of Duyun Mao Jian Tea at different concentrations on enzymatic activity of CYP3A of mice liver microsome at different time points

(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與用藥1周組比較，P<0.01；(3)與用藥2周組比較，P<0.01；(4)與低劑量組比，較，P<0.01；5)與中劑量組比較，P<0.01

2.2 CYP3A11 基因的RT-PCR分析

隨著綠茶作用時(shí)間的延長和劑量的增大， CYP3A11 mRNA的表達(dá)逐漸降低。各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、表2。

3 討論

微粒體CYP450與NADPH-CYP450氧化還原酶及脂質(zhì)雙層共同構(gòu)成混合功能氧化酶系(mixed function oxidase system ,MFOS)，負(fù)責(zé)藥物、致癌物、環(huán)境化合物、一些內(nèi)源性生成物的生物轉(zhuǎn)化作用[10]。CYP450的抑制和誘導(dǎo)可改變一些藥物、環(huán)境化合物、前致癌物等在體內(nèi)的代謝[11]。在所有的CYP450酶中，CYP3A因含量豐富及底物范圍廣泛而具有相當(dāng)?shù)闹匾裕s有40%～50%的藥物在人體的代謝都經(jīng)由CYP3A催化。因此CYP3A酶活性增高，藥物的代謝速率加快、半衰期縮短、血藥濃度降低，常規(guī)劑量給藥常不能取得預(yù)期臨床療效；酶活性降低，則藥物清除率降低、半衰期延長、易出現(xiàn)藥物蓄積引起的各種藥物不良反應(yīng)。因此CYP3A活性的研究，可為預(yù)測最佳給藥劑量以達(dá)到提高藥物治療效果、減少不良反應(yīng)的目的。CYP3A代謝的藥物主要有硝苯地平、紅霉素、特非那丁、咪達(dá)哇苯妥英、美替沙侖、皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素、地西泮和嗅派醇酮等。CYP3A家族中在成人肝臟參與藥物代謝的主要是CYP3A4，在小鼠體內(nèi)，參與藥物代謝的CYP3A亞系包括CYP3A11、CYP3A13、CYP3A16、CYP3A25、CYP3A41、CYP3A44、CYP3A57、CYP3A59等，其中CYP3A11是含量最豐富也是最重要的亞型之一，占肝臟中CYP450總含量的20%以上[12]。由于CYP3A家族擔(dān)負(fù)了大部分藥物及人體內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，因此當(dāng)其活性受到影響，會(huì)引起這些藥物在體內(nèi)的代謝發(fā)生改變或影響藥效，或蓄積而引起中毒現(xiàn)象及發(fā)生藥物副作用。

注：“對”為對照組，L1、L2、L3 分別為毛尖低劑量1周組、2周組、3周組，M1、M2、M3分別為毛尖中劑量1周組、2周組、3周組，H1、H2、H3分別為毛尖高劑量1周組、2周組、3周組

表2 都勻毛尖灌胃不同時(shí)間對小鼠CYP3A11 mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effect of Duyun Mao Jian Tea at different concentrationson the mRNA expressions of CYP3A11 of mice liver microsome at different time points

(1)與對照組比較P<0.01；(2)與用藥1周組比較P<0.01，(3)與用藥2周組比較P<0.01；(4)與低劑量組比較P<0.01，(5)與中劑量組比較P<0.01

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，都勻毛尖呈時(shí)間-劑量依賴性抑制CYP3A的酶活性，同時(shí)也使CYP3A11 mRNA的表達(dá)呈時(shí)間-劑量依賴性降低 ，說明都勻毛尖可能是通過降低CYP3A11轉(zhuǎn)錄水平來使酶活性受到抑制的，因此由CYP3A代謝的藥物如與都勻毛尖茶湯同時(shí)使用可能會(huì)使這些藥物在體內(nèi)的代謝減慢，長期使用可能會(huì)造成蓄積甚至中毒，引起一些不良的藥物反應(yīng)。

[1] Ingelman SM. Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy: the past, present and future [J]. Trends Pharmacol Sci, 2004(4):193-200.

[2] 張藝婷，王曉飛，魏之昀，等. Has-miR-660負(fù)調(diào)控人類肝臟組織中藥物代謝酶CYP3A4的表達(dá)[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013(5):505-510.

[3] 韋友歡，黃秋嬋，陸維坤．解讀茶葉與人體健康[J]．廣東茶業(yè)， 2008(1):24-27．

[4] 黃秋嬋，韋友歡. 綠茶功能性成分對人體健康的生理效應(yīng)及其機(jī)制研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(17):7975-7976,7990.

[5] 李佳，陳路軍，陳潔，等. 酒后飲綠茶對小鼠腎功能影響的實(shí)驗(yàn)性研究[J].探索性醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)—教學(xué)改革與實(shí)踐, 2007(5):21-29.

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 1994:512-512.

[7] 張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法 [M]. 北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社， 1998:1652-1652.

[8] Elliott D. A proteomic analysis of liver mitochondria during acute endotoxeomia[J]. Intensive Care Med, 2006(32):1252-1262.

[9] Zhang QY， Debble Dunbar. Characterization of mouse small intestinal cytochrome P450 expression[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2003(11):1360-1351.

[10]周宏灝.遺傳藥理學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社， 2001:62-62.

[11]王福宏，王福力.桂枝湯對大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶活性的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2014(11):2780-2782．

[12]van-Herwaarden AE, Wangenaar E, vanderR-Kruijssen CM, et al. Knockout of cytochrom P450 3A yields new mouse models for understanding xeonbiotic metabolism [J]. J Clin Invest, 2007(11):3583-2592.

(2015-02-25收稿，2015-03-15修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 劉 華

醫(yī)學(xué)名詞術(shù)語使用規(guī)范

名詞、術(shù)語應(yīng)統(tǒng)一，不要一義多詞或一詞多義。婦產(chǎn)科學(xué)、耳鼻咽喉科學(xué)、血液病學(xué)、呼吸病學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、眼科學(xué)和外科學(xué)的名詞已由醫(yī)學(xué)名詞審定委員會(huì)審定公布，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行，其它尚未審定者，目前以下列2個(gè)主題詞索引為準(zhǔn)：(1)《醫(yī)學(xué)主題詞注釋字順表中文索引》(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)信息研究所)；(2)《中醫(yī)藥主題詞表》(中國中醫(yī)研究院圖書情報(bào)研究所)。在這2個(gè)主題詞表中找不到者，則以人民衛(wèi)生出版社出版的《英漢醫(yī)學(xué)詞匯》、化學(xué)工業(yè)出版社出版的《藥名詞匯》和科學(xué)出版社出版的各學(xué)科名詞審定本為準(zhǔn)。如“發(fā)燒”應(yīng)改為“發(fā)熱”，“紅血球”應(yīng)改為“紅細(xì)胞”，“血色素”應(yīng)改為“血紅蛋白”，“剖腹產(chǎn)術(shù)”應(yīng)改為“剖宮產(chǎn)術(shù)”等。國內(nèi)尚無統(tǒng)一譯名的，參考以上詞典慎重?cái)M定，并在譯名后加括號(hào)加注外文，在醫(yī)學(xué)名詞審定委員會(huì)正式公布后，應(yīng)立即嚴(yán)格遵照執(zhí)行。

《貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》編輯部

Effect of Duyun Mao Jian Tea on Enzymatic Activities and mRNA Expression of CYP3A in Mouse Liver

WANG Zhuting, LI Hongmei, LEI Tingwen

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To study the effects of green tea (Duyun Mao Jian tea ) on enzymatic activity and mRNA expression of cytochrome P4503A(CYP3A)in mouse liver and to analyze its effect on drug metabolism. Methods: Kunming male mice were randomly divided into four groups. Control group was given food and water as normal, and the other three groups were were given Duyun Mao Jian tea-soup at doses of 0.25 g/(kg·d), 0.5 g/(kg·d) and 1 g/(kg·d) by gavage respectively for 3 consecutive weeks at most. The mice were killed at 1stweek, 2ndweek and 3rdweek respectively and the mice liver microsome were extracted. Then the enzymatic activity of CYP3A was determined by spectrophotography. RT-PCR was adopted to detect mRNA expression levels of CYP3A11. Results: Duyun Mao Jian Tea could inhibit the enzymatic activity of CYP3A not only time-dependently but also dose-dependently. Meanwhile, Duyun Mao Jian Tea inhibited the mRNA expression of CYP3A11 not only time-dependently but also dose-dependently. Conclusions: Duyun Mao Jian Tea can inhibit the enzymatic activity and mRNA expression of CYP3A not only time-dependently but also dose-dependently, indicating that Duyun Mao Jian tea can affect drug metabolism by inhibiting enzymatic activity of CYP3A and in turn may result in some side-effect.

green tea; cytochrome P450; enzyme activity; metabolic detoxication, drug

貴陽醫(yī)學(xué)院院基金(K2009-9)

時(shí)間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1316.032.html

R34-33; R969.1

A

1000-2707(2015)05-0471-04

**通信作者 E-mail:leitw@sina.com