大鼠失神經(jīng)不同時(shí)相的骨骼肌形態(tài)和MyoD表達(dá)變化

董 進(jìn)，柯棠山，劉坤祥，2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院解剖教研室，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563099）

大鼠失神經(jīng)不同時(shí)相的骨骼肌形態(tài)和MyoD表達(dá)變化

董 進(jìn)1，柯棠山1，劉坤祥1，2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院解剖教研室，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563099）

目的研究大鼠失坐骨神經(jīng)后MyoD在腓腸肌中不同時(shí)相的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討骨骼肌失神經(jīng)后再生修復(fù)機(jī)制。方法將48只2月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為八組，每組6只。其中正常對(duì)照和失神經(jīng)各四組，于術(shù)后2、7、14、28 d取材，分別標(biāo)記為Z1、Z2、Z3、Z4組和S1、S2、S3、S4組。在相應(yīng)的時(shí)相內(nèi)取各組大鼠左、右后肢的腓腸肌測(cè)肌濕重后凍存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。計(jì)算各組腓腸肌濕重比及其肌腹段HE染色后的橫截面積，Western blotting檢測(cè)MyoD在腓腸肌的表達(dá)。結(jié)果手術(shù)組失神經(jīng)側(cè)（S1F右、S2F右、S3F右、S4F右）大鼠腓腸肌濕重逐漸減小，且各時(shí)相肌濕重比比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HE染色后腓腸肌的各時(shí)相平均橫截面積逐漸減小，即各時(shí)相組內(nèi)與組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blotting檢測(cè)各時(shí)相失神經(jīng)側(cè)較正常對(duì)照組腓腸肌的MyoD表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論大鼠腓腸肌失坐骨神經(jīng)后第1周內(nèi)出現(xiàn)明顯肌萎縮現(xiàn)象，且萎縮速度在失神經(jīng)前2周較快；MyoD蛋白在大鼠失坐骨神經(jīng)后的表達(dá)增加，在失神經(jīng)第2周時(shí)其表達(dá)量最高，隨后開始降低，但仍高于正常大鼠。

骨骼肌； 肌形成調(diào)節(jié)因子； 肌萎縮； 坐骨神經(jīng)； 去神經(jīng)支配； 大鼠，Sprague-Dawley

周圍神經(jīng)損傷所致骨骼肌萎縮是臨床常見的創(chuàng)傷疾病，而肌肉的再生與萎縮是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分子生物學(xué)調(diào)控過程。近年來相關(guān)研究表明，在此過程中成肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子具有重要作用。其中MRFs又稱MyoD家族[1-3]，主要包括MyoD、myogenin、myf-5、MRF4等成員，是一組具有生肌能力的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中MyoD、myogenin的作用尤為突出，MyoD對(duì)其他類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞在分化為肌管的過程中起重要作用。在特異性基因轉(zhuǎn)錄中起著總開關(guān)的作用；有研究表明，MRFs可參與肌肉損傷修復(fù)，相關(guān)研究主要集中于創(chuàng)傷、神經(jīng)源性和肌源性肌?。ㄈ缂I養(yǎng)不良癥）所致的損傷[3-6]。而有關(guān)失神經(jīng)所導(dǎo)致骨骼肌萎縮與MRFs，尤其與MyoD、myogenin蛋白表達(dá)的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究通過觀察失坐骨神經(jīng)后大鼠骨骼肌MyoD蛋白水平的變化，進(jìn)一步探討MyoD與骨骼肌失神經(jīng)萎縮變化及修復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡健康雄性SD大鼠48只[普通級(jí)，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0005]，體質(zhì)量（220±20）g，隨機(jī)分為八組，每組6只，分籠飼養(yǎng)。其中正常對(duì)照和失神經(jīng)各四組分別于術(shù)后2、7、14、28 d取材，標(biāo)記為Z1、Z2、Z3、Z4組和S1、S2、S3、S4組。

1.1.2 主要試劑與儀器 MULTISKAN酶標(biāo)儀（Thero Scientific），Bio-Rad伯樂Mini-PROTEAN Tetra電泳槽，PowerPacTMBasic電泳儀（BIO-Rad），Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)（LI-COR公司）；HE染色試劑盒，RIPA裂解液（Beyotime），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beyotime），苯甲基磺酰氟（PMSF），Tris（Bio-Rad），十二烷基磺酸鈉（SDS，Sigma），濃鹽酸，5×SDS上樣緩沖液，脫脂奶粉，吐溫-20（Beyotime），PVDF膜，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Thermo scientific），兔抗大鼠GAPDH一抗（Proteintech），山羊抗兔熒光二抗。

1.2 方法

1.2.1 失神經(jīng)模型的構(gòu)建 將48只SD大鼠飼喂4 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分組稱質(zhì)量，標(biāo)記。四組大鼠去坐骨神經(jīng)模型，用濃度為3 mg/mL戊巴比妥鈉以1 mL/100 g劑量進(jìn)行腹腔麻醉后，取俯臥位，無菌操作下暴露其坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣剪斷其坐骨神經(jīng)1 cm，縫合皮膚，等待其復(fù)蘇，放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。

1.2.2 大鼠骨骼肌取材 分別于術(shù)后2、7、14、28 d稱質(zhì)量，麻醉后，在無菌條件下取雙后肢的腓腸肌稱其肌濕重，同時(shí)計(jì)算肌濕重比[（S右/S左）/（Z右/Z左）]。取相應(yīng)肌腹段約0.5 cm寬放入4%多聚甲醛固定標(biāo)記以備HE染色。其余放入凍存管于液氮凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 肌肉組織HE染色 將已固定的組織標(biāo)本通過自來水沖洗，經(jīng)梯度乙醇脫水后二甲苯透明后浸蠟包埋，然后將石蠟包埋的組織行8 μm厚的切片，于溫水中攤片用載玻片貼片；再進(jìn)行脫蠟HE染色，經(jīng)乙醇脫水后甲苯透明，最后中性樹膠封片固定，以備顯微鏡觀察采集圖片，取200倍視野下計(jì)算肌肉橫截面積。

1.2.4 Western blotting技術(shù)檢測(cè)MyoD蛋白表達(dá) （1）蛋白的提取及定量：液氮研磨法提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）行蛋白定量后再行蛋白變性。（2）電泳：中間各孔加10 μL樣品，兩側(cè)加Marker，5%濃縮膠80 V，20 min；12%分離膠120 V，65 min。（3）轉(zhuǎn)膜：低溫300 mA恒流電轉(zhuǎn)55 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。（4）封閉：5%脫脂奶粉封閉1.5 h。（5）一抗孵育：將一抗孵育PVDF膜4℃過夜后，PVDF膜用TBST洗膜3次，每次5 min。（6）二抗孵育：山羊抗兔熒光二抗在37℃、水平搖床上孵育1.5 h，用TBST洗膜2次，每次5 min，再用TBST洗膜5 min后行Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Image-Pro Plus軟件計(jì)算圖像橫截面積；應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠平均肌濕重比較 同時(shí)相手術(shù)組失坐骨神經(jīng)（右）側(cè)腓腸肌（SXF右，x代表第1、2、3、4組）與其對(duì)側(cè)（SXF左）肌濕重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；手術(shù)側(cè)腓腸肌平均肌濕重隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小，即S1F右與S2F右、S3F右、S4F右平均肌濕重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠腓腸肌平均肌濕重比較（±s，g）

表1 各組大鼠腓腸肌平均肌濕重比較（±s，g）

注：與同組同時(shí)相左側(cè)比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與同組S1比較，cP＜0.01。

時(shí)間 手術(shù)組（n=6）F右 F左時(shí)間 正常對(duì)照組（n=6）F右 F左S1 S2 S3 S4 1.34±0.06 1.36±0.07 1.50±0.05 1.90±0.06 1.24±0.08a0.95±0.10bc0.73±0.06bc0.56±0.14bcZ1 Z2 Z3 Z4 1.33±0.17 1.49±0.17 1.50±0.18 1.78±0.15 1.33±0.17 1.48±0.17 1.51±0.17 1.78±0.18

2.2 各時(shí)相腓腸肌肌濕重比 術(shù)后2、7、14、28 d肌濕重比（0.922、0.703、0.530、0.298）逐漸減小，相鄰兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且肌濕重比隨時(shí)間變化第1周內(nèi)萎縮速度最快，第2周后萎縮速度逐漸變緩。見圖1。

圖1 肌濕重比隨時(shí)間變化圖

2.3 HE染色后各時(shí)相肌肉橫截面積

2.3.1 各時(shí)相手術(shù)與正常右側(cè)肌肉形態(tài) 肌肉橫截面積隨失神經(jīng)時(shí)間增加而逐漸減小，肌纖維形態(tài)變得不規(guī)整，膠原纖維組織增生，隨失神經(jīng)時(shí)間的延長(zhǎng)肌萎縮趨勢(shì)逐漸減小。見圖2。

2.3.2 各組各時(shí)相肌肉橫截面積比較 腓腸肌橫截面同時(shí)相手術(shù)側(cè)（SXF右）與其對(duì)側(cè)（SXF左）橫截面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與同時(shí)相正常對(duì)照組橫截面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；手術(shù)側(cè)腓腸肌相鄰兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。手術(shù)側(cè)腓腸肌橫截面積隨失神經(jīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組各時(shí)相MyoD表達(dá)情況 各時(shí)相手術(shù)組與正常對(duì)照組右側(cè)腓腸肌所測(cè)MyoD/GAPDH百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；手術(shù)組MyoD蛋白表達(dá)量在第14天時(shí)出現(xiàn)高峰，隨后開始降低，但仍高于正常對(duì)照側(cè)。見圖3、4。

圖2 各組各時(shí)相HE染色圖（200×）

表2 各組各時(shí)相肌肉橫截面積比較（±s，×102μm2）

表2 各組各時(shí)相肌肉橫截面積比較（±s，×102μm2）

注：與同組同時(shí)相左側(cè)比較，aP＜0.05；與正常對(duì)照組同時(shí)相比較，bP＜0.05；cP＜0.05。

時(shí)間 手術(shù)組（n=6）F右 F左時(shí)間 正常對(duì)照組（n=6）F右 F左6.01±0.73 7.62±0.68 8.22±0.81 8.59±0.52 S1 S2 S3 S4 5.11±0.75ab4.52±0.32abc2.97±0.37abc2.03±0.49abc6.04±0.85 7.62±0.34 8.21±0.42 8.61±0.37 Z1 Z2 Z3 Z4 6.00±0.77 7.60±0.38 8.21±0.66 8.59±0.30

圖4 MyoD與GAPDH灰度值百分比條形圖

3 討 論

近年來相關(guān)研究表明，在肌肉的再生與萎縮過程中，MRFs和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子具有重要作用[4-6]。對(duì)其他類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞分化為肌管的過程中起重要作用，在特異性基因轉(zhuǎn)錄中起著總開關(guān)作用。有研究用Oct4的DNA結(jié)合區(qū)域融合性蛋白與MyoD強(qiáng)大轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其具有誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑的能力，可使已誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞（iPSCs）增加50倍[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，失神經(jīng)的骨骼肌均會(huì)出現(xiàn)不同程度的萎縮，且隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)肌肉萎縮程度逐漸增加；并伴隨著一系列的組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)改變，肌肉橫截面積逐漸減小，肌纖維形態(tài)變得不規(guī)整，膠原纖維組織增生，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)肌萎縮速度逐漸減緩。這一結(jié)果可能與成肌調(diào)節(jié)因子的激活有關(guān)。

MyoD是一個(gè)具有bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸末端具有強(qiáng)大而簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[6-8]。在肌肉生成方面，MyoD是使許多基因的基因座染色質(zhì)重塑和募集具有活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子[5，9-10]。胚胎時(shí)期，MyoD是由形成體節(jié)過程中的肌源性前體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的，對(duì)脊柱旁肌肉的形成非常重要[11]。有研究表明，MRFs可參與肌肉損傷修復(fù)，且對(duì)神經(jīng)源性和肌源性肌病（如肌營養(yǎng)不良癥）所致的損傷也有一定的修復(fù)作用[3-6]。MyoD去神經(jīng)骨骼肌肉中的表達(dá)觀點(diǎn)不一，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為去神經(jīng)為上調(diào)，但有的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)后MyoD表達(dá)不僅不增高反而下降，失神經(jīng)損傷后導(dǎo)致MRFs表達(dá)差異的原因至今仍不太清楚[5，12-13]。研究表明，大鼠失神經(jīng)性損傷的骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞MyoD+、myogenin+在損傷后的早期表達(dá)上調(diào)，2個(gè)月后急劇下降，1年后幾乎不能檢測(cè)到肌衛(wèi)星細(xì)胞的存在[14-15]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，各時(shí)相失神經(jīng)骨骼肌中MyoD蛋白表達(dá)量均較正常對(duì)照組增加；且失神經(jīng)組MyoD蛋白表達(dá)量在術(shù)后14 d時(shí)出現(xiàn)高峰，術(shù)后28 d時(shí)表達(dá)量降低但仍高于正常對(duì)照側(cè)。

大鼠腓腸肌失坐骨神經(jīng)后7 d內(nèi)出現(xiàn)明顯肌萎縮，且萎縮速度較快；MyoD蛋白在大鼠失坐骨神經(jīng)后的表達(dá)增加，在失神經(jīng)后7 d其表達(dá)量最高，隨后開始降低，但仍高于正常對(duì)照組。由于大鼠失神經(jīng)出現(xiàn)肌萎使MyoD蛋白表達(dá)增加，從而減緩了大鼠肌肉的萎縮速度，而長(zhǎng)時(shí)間失神經(jīng)可導(dǎo)致不可逆性肌萎縮，從而刺激MyoD蛋白進(jìn)一步表達(dá)增加；而由于成肌細(xì)胞逐漸耗竭和某些凋亡因子的作用，導(dǎo)致了MyoD蛋白的表達(dá)又開始逐漸減少，從而出現(xiàn)了表達(dá)高峰。

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Changes in the protein expression of MyoD and the skeletal muscles morphology of rats after denervation in different time phases

Dong Jin1，Ke Tangshan1，Liu Kunxiang1，2
（1.Department of Anatomy，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China；2.Central Laboratory of Biology and Medicine，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China）

ObjectiveTo explore the expression changes of MyoD after losing the sciatic nerve in rats′gastrocnemius musle at different time phases in order to investigate the skeletal muscle regeneration and repair mechanisms after denervation further.MethodsA total of 48 male SD rats aged 2-month-old were randomly divided into 8 groups，6 of each group including the 4 normal control groups and the 4 nerve-lost groups，obtaining the samples after 2，7，14，28 d respectively，marking group Z1，Z2，Z3，Z4and group S1，S2，S3，S4.It was removed the gastrocnemius muscle from the latter legs of each group in the different time phases to measure their wet muscle weight and then frozed to prepare the following experiements.The wet weight ratio of the gastrocnemius muscle and the cross-sectional area of musle belly setions stainied by HE.The expression of gastrocnemius muscle was detected by Western blotting.ResultsThe wet musle weight was gradually decreased in the denervation side（S1Fright，S2Fright，S1Fright，S4Fright）from the operation groups.There were statistically significant compared the wet weight among the above time pahses（P＜0.05）.The average cross-sectional area after HE staining was declined at different time phases，whose difference had statisti cal significance within the group and among the groups（P＜0.05）.The denervation sides in various time phases were increased than the normal control groups in MyoD protein by Western blotting.The difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe amyotrophy occurred within 1 week after loseing ischiadic nerve of rats′gastrocnemius muscle and accelerated in the first two weeks.The MyoD protein expression were increased after loseing their ischiadic nerve.The expression amount reaches the peak at the second week of denervation，then began to decrease but still higher than controls.

Muscle，skeletal； Myogenic regulatory factors； Muscular atrophy； Sciatic nerve； Denervation；Rats，sprague-dawley

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.002

：A

：1009-5519（2015）08-1124-03

2015-01-08）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字[2009]2號(hào)）。

董進(jìn)（1987-），男，貴州沿河人，在讀碩士研究生，主要從事骨骼肌失神經(jīng)萎縮方面的研究；E-mail：601137533@qq.com。

劉坤祥（E-mail：1684429795@qq.com）。