IL-31對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549表達(dá)CCL2的影響

高 婧，杜青波，譚艷芳，岳 歡，黃俊瓊，2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義563099）

IL-31對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549表達(dá)CCL2的影響

高 婧1，杜青波1，譚艷芳1，岳 歡1，黃俊瓊1，2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義563099）

目的通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究IL-31對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549表達(dá)趨化因子C-C趨化因子配體2（CCL2）的影響，探討IL-31在支氣管哮喘氣道炎癥中的作用。方法體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549，用不同濃度（10、50、100 ng/mL）IL-31作用A549細(xì)胞、相同濃度（10 ng/mL）IL-31作用A549細(xì)胞不同時(shí)間（12、24、36 h），收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，熒光定量PCR法分析趨化因子CCL2 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果不同濃度IL-31作用于A549細(xì)胞后，趨化因子CCL2的表達(dá)較正常未處理組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；10 ng/mL IL-31作用A549細(xì)胞后，不同時(shí)間段CCL2的表達(dá)均增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論IL-31作用于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549后，趨化因子CCL2的表達(dá)明顯增高，表明IL-31可能誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞分泌趨化因子參與哮喘氣道炎癥過(guò)程。

趨化因子CCL2； 白細(xì)胞介素類(lèi)； 肺泡/細(xì)胞學(xué)； 哮喘； 氣管炎

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是氣道的慢性炎癥，是多種炎性細(xì)胞的長(zhǎng)期浸潤(rùn)和聚集。而趨化因子在激活淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)其遷移、黏附和建立化學(xué)趨化梯度的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CC趨化因子配體 2（CCL2）是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)最早的、有活性的趨化因子，是CC類(lèi)趨化因子家族的成員。CCL2在哮喘氣道上皮和肺泡灌洗液（BALF）中高表達(dá)，能趨化、激活嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，促使其釋放大量組胺和白三烯等，可能參與哮喘的急性發(fā)作和氣道炎癥的形成。IL-31在炎性疾病中發(fā)揮重要的作用，有研究證明，IL-31可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IL-31作用人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549，熒光定量PCR檢測(cè)A549細(xì)胞CCL2的分泌情況，進(jìn)一步探討IL-31與哮喘氣道炎癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人IL-31（近岸蛋白質(zhì)科技有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自HYclone公司，總RNA提取試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自天根生物公司，A549細(xì)胞由本院微生物教研室王歡教授所贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 將液氮中凍存的裝有A549細(xì)胞的凍存管取出后，放入37℃溫水中使其迅速融化。移液器轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入RPMI1640培養(yǎng)液，1 000 r/min、離心3～5 min，倒掉廢液，加入新的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 A549的傳代 A549細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，當(dāng)鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時(shí)，用無(wú)菌PBS清洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液0.2～0.5 mL，室溫下平置3～5 min，見(jiàn)瓶底細(xì)胞變圓、脫落時(shí)，加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞成懸液，轉(zhuǎn)移至新的離心管，1000r/min、離心3～5min，棄廢液，加入新的培養(yǎng)液，按1∶2傳代后放入CO2培養(yǎng)，適時(shí)換液。

1.2.3 不同濃度IL-31作用A549相同時(shí)間 將A549細(xì)胞傳至第2代，按1×105個(gè)/瓶培養(yǎng)于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，細(xì)胞同一化12 h，然后加入不同濃度的人IL-31，濃度依次為10、50、100 μg/mL，置入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 相同濃度IL-31作用A549不同時(shí)間 將A549細(xì)胞傳至第2代，按1×105個(gè)/瓶培養(yǎng)于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，細(xì)胞同一化12 h，加入相同濃度（10 μg/mL）的IL-31作用于同一化的細(xì)胞，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12、24、36 h。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)CCL2的表達(dá) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后取0.5 mL的反應(yīng)管配制20 μL RT-PCR反應(yīng)液：反應(yīng)管中依次加入滅菌蒸餾水7μL，CCL2的上、下游引物各0.5μL，熒光染料（SYBR premix Ex TaqTM）10 μL，DNA模板2μL，進(jìn)行兩步法熒光定量PCR：95℃、3 min；95℃、10 s；57℃、30 s；55℃、3s。CCL2引物：上游5′-CTTCTGTGCCTGCTGCTCATA-3′，下游5′-CTTTGGGACACTTGCTGCTG-3′。β-actin引物：上游5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC3′，下游5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′。擴(kuò)增結(jié)果用熒光定量PCR相對(duì)定量2-ΔΔCt法的計(jì)算方法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度（10、50、100 ng/mL）IL-31作用A549細(xì)胞后CCL2的表達(dá) 熒光定量PCR分析顯示，不同濃度IL-31作用于A549細(xì)胞后CCL2的表達(dá)均較未處理組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.16、2.35、2.30，P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同濃度IL-31對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響（±s）

表1 不同濃度IL-31對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響（±s）

注：-表示無(wú)此項(xiàng)；與未處理組比較，t=2.16、2.35、2.30，aP＜0.05。

組別未處理組IL-31組（ng/mL）10 50 100△Ct（CCL2-β-actin）10.39±0.85△△Ct 2-△△Ct--8.71±1.27a9.23±0.60a10.00±1.42a-1.68 -1.16 -0.39 3.21 2.23 1.31

圖1 各濃度組A549細(xì)胞CCL2的表達(dá)

2.2 IL-31不同作用時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響 通過(guò)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)相同濃度IL-31作用于A549細(xì)胞后CCL2的表達(dá)均較未處理組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.30、2.36、2.28，P＜0.05），見(jiàn)表2、圖2。

表2 IL-31作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響（±s）

表2 IL-31作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響（±s）

注：-表示無(wú)此項(xiàng)；與未處理組比較，t=2.30、2.36、2.28，aP＜0.05。

組別未處理組IL-31組作用時(shí)間（h）12 24 36△Ct（CCL2-β-actin） △△Ct 2-△△Ct10.39±0.85--8.88±1.06a8.71±1.27a8.51±1.26a-1.51 -1.68 -1.88 2.85 3.21 3.69

圖2 IL-31作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響

3 討 論

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其主要病理生理基礎(chǔ)表現(xiàn)為肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)。哮喘的發(fā)病機(jī)制有很多種，其中對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子，包括IL、炎癥介質(zhì)、趨化因子等參與氣道慢性炎癥的調(diào)節(jié)。

IL在哮喘中發(fā)揮重要作用，主要包括參與炎癥細(xì)胞的成熟和活化、調(diào)節(jié)趨化因子合成和分泌等。其中IL-6是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，在多種炎性反應(yīng)中均增高，參與調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，在哮喘中發(fā)揮著重要作用[2]。IL-31是于2004年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，為一個(gè)具有4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的單鏈分子[3]，主要功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)造血，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子、趨化因子分泌[1，4-5]，屬于IL-6家族的成員，主要由激活的Th2細(xì)胞分泌。研究發(fā)現(xiàn)，IL-31與過(guò)敏性疾病關(guān)系密切，在哮喘小鼠模型中，肺組織和支氣管脫落細(xì)胞IL-31R的表達(dá)明顯增高[3]。表明其在哮喘發(fā)作中IL-31可能發(fā)揮重要作用。

在哮喘氣道慢性炎癥的形成中，趨化因子的作用占重要地位。趨化因子是一組具有趨化作用的細(xì)胞因子，能吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部，參與免疫調(diào)節(jié)。趨化因子對(duì)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞均有趨化作用，在炎癥、變態(tài)反應(yīng)等疾病中均有趨化因子及其受體的參與。與哮喘氣道慢性炎癥的形成有重要聯(lián)系的趨化因子主要有兩大類(lèi)，CC趨化因子和CXC家族。CCL2屬于CXC家族，CCL2與其相應(yīng)的趨化因子受體CC趨化因子受體2（CCR2）結(jié)合后可活化單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞，并向炎癥部位聚集。IL-4與IL-31有非常相似的生物學(xué)活性，可以直接促進(jìn)IgE合成，引起嗜酸性粒細(xì)胞聚集、黏液分泌增加，導(dǎo)致氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性[6-8]。體外實(shí)驗(yàn)表明，IL-4與IL-31聯(lián)合可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)CCL2[3]。Schneider等[9]證實(shí)，由支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2可能有助于加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-31能增強(qiáng)一些趨化因子的分泌，如巨噬細(xì)胞來(lái)源的趨化因子、胸腺和活化趨化因子及T細(xì)胞活化蛋白-3等，并且趨化因子的分泌與IL-31的關(guān)系呈正相關(guān)[10]。另有研究證實(shí)，IL-31刺激人的支氣管上皮細(xì)胞分泌趨化因子的能力增強(qiáng)，并且與時(shí)間和濃度呈依賴(lài)性[1]。

作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中趨化因子CCL2表達(dá)增高[11]。本研究中，作者用IL-31作用于肺組織來(lái)源的A549細(xì)胞，觀察趨化因子CCL2的分泌情況。采用不同濃度IL-31誘導(dǎo)A549細(xì)胞后，用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞分泌CCL2的情況。結(jié)果顯示，在IL-31誘導(dǎo)細(xì)胞后，不同濃度IL-31均能上調(diào)CCL2的表達(dá)。采用同樣方法，用10 μg/mL IL-31誘導(dǎo)A549細(xì)胞，于12、24、36 h后CCL2的分泌與未處理組相比均增加，這一結(jié)果與IL-31募集、活化趨化因子的生物活性有關(guān)系。說(shuō)明IL-31可誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞分泌趨化因子參與哮喘氣道炎癥。IL-31促使趨化因子分泌增多，趨化炎癥細(xì)胞炎癥部位，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，促進(jìn)這些炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，引起氣管平滑肌收縮、細(xì)胞通透性增加、炎性物質(zhì)滲出增多、管壁增厚、管腔變窄，形成氣道的慢性炎癥。長(zhǎng)期、反復(fù)的炎癥刺激導(dǎo)致氣管上皮結(jié)構(gòu)改變，氣道組織結(jié)構(gòu)重組，加重氣管阻力，增加呼吸做功，最終加重哮喘的癥狀。

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Effect of IL-31 on the expression of CCL2 in typeⅡalveolar epithelial cells A549

Gao Jing1，Du Qingbo1，Tan Yanfang1，Yue Huan1，Huang Junqiong1，2
（1.Department of Clinical Laboratory，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，，China）

ObjectiveTo explore the effect of of IL-31 on airway inflammation of bronchial asthma by studying the effect of IL-31 on the expression of CCL2 in typeⅡalveolar epithelial cells A549 in vitro.MethodsThe typeⅡalveolar epithelial cells A549 were cultured in vitro，with the different-concentration IL-31 solution including 10，50，100 ng/mL acting on them and the same concentration IL-31（10 ng/mL）acting on the them for different times including 12，24 h and 36 h，and then collected the cells and extracted the total cellular RNA.The mRNA expression of chemokine CCL2 were measured by fluorescent real-time PCR assay.ResultsCompared with the normal treatment group，the mRNA expression of chemokine CCL2 was significantly increased with different concentrations of IL-31 impacting on the A549 cells.The difference was statistically significant（P＜0.05）；The mRNA expression of chemokine CCL2 was increased with 10 ng/mL IL-31 impacting on the A549 cells at different time periods.The difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionThe expression of chemokine CCL2 is obviously increased with the impact of IL-31 acting in type II alveolar epithelial cells A549，which indicates that IL-31 may probably induce lung tissue cells to secrete chemokines involving in asthmatic airway inflammation.

Chemokine CCL2； Interleukins； Pulmonary alveoli/cytology； Asthma； Tracheitis

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.001

：A

：1009-5519（2015）08-1121-03

2014-12-30）

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高婧（1988-），女，河南許昌人，碩士研究生，主要從事臨床免疫方面研究；E-mail：478729521@qq.com。

黃俊瓊（E-mail：junqiongh@aliyun.com）。

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