廣東佛山地區(qū)兒童地中海貧血基因型分析

林業(yè)輝 潘志偉 周杏 宋春林

（1.佛山市婦幼保健院兒科；2.佛山市婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528000）

地中海貧血（地貧）是由于一種或多種珠蛋白肽鏈合成受阻或完全抑制，導(dǎo)致血紅蛋白成分組成異常，而引起的慢性溶血性貧血，屬于一種常染色體不完全顯性遺傳病。佛山地處珠三角腹地，亦是地貧高發(fā)地區(qū)，為探討本地區(qū)地貧基因型的分布特征，本文對(duì)來(lái)我院就診和體檢的部分兒童進(jìn)行地貧基因檢測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月至2011年7月在我院兒科住院部、門診和兒童保健科就診和體檢的兒童平均紅細(xì)胞體積（MCV）＜82fl者。

1.2 儀器和試劑（1）Sysmex XT－2000i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀：日本希森美康公司生產(chǎn)，XT－2000i所用測(cè)定試劑由該公司提供。（2）CR 擴(kuò)增儀：美國(guó)BioRad 公司生產(chǎn)的icycler擴(kuò)增儀（或美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的2720 擴(kuò)增儀），DNA 抽提試劑盒、α地貧基因診斷試劑盒和β地貧基因診斷試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供，電泳所需0.8% 瓊脂糖凝膠等為自配。

1.3 方法（1）MCV 測(cè)定：使用Sysmex XT－2000i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)全部受檢兒童進(jìn)行血細(xì)胞分析。（2）基因診斷：對(duì)經(jīng)血細(xì)胞分析MCV＜82fl者用無(wú)菌EDTA 抗凝管抽取靜脈血2mL；采用DNA快速提取試劑盒提取DNA，再用α地貧基因診斷試劑盒，以缺口PCR（gap－PCR）為原理的單管多重PCR（M－PCR）進(jìn)行α地貧基因檢測(cè)；同時(shí)用β地貧基因診斷試劑盒，以反向點(diǎn)雜交芯片法進(jìn)行β地貧基因檢測(cè)。具體步驟按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，不同組間率或構(gòu)成比的比較用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童地貧的檢出率 血細(xì)胞分析MCV＜82fl者1 341例，其中男896例，女445例，年齡0～14歲。確診地貧848例，男544例（60.7%），女304例（68.3%），男、女檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中α地貧471例，檢出率35.1%；β地貧377例，檢出率28.1%。不同年齡段兒童地貧檢出率不同，嬰兒期（＜1歲）地貧檢出率54.6%（339／621），幼兒期（～3歲）地貧檢出率63.7%（314／493），學(xué)齡前期（～7歲）地貧檢出率81.7%（143／175），學(xué)齡期（～14歲）地貧檢出率100%（52／52），兒童地貧檢出率隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸增高（P＜0.01）。

2.2 地貧患兒的基因型和基因頻率（1）α地貧患兒的基因型和基因頻率：本反應(yīng)體系可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1.8、2、1.6和1.3kbp的4個(gè)條帶，分別代表人類α珠蛋白基因（即正常人）、3.7缺失型、4.2缺失型、SEA組缺失型的擴(kuò)增產(chǎn)物。陰性對(duì)照管無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照管出現(xiàn)長(zhǎng)度約為1.3和1.8kbp組的2組個(gè)條帶，分別為－SEA缺失型和正常α珠蛋白基因擴(kuò)增的產(chǎn)物。本組資料471例α地貧患兒中，以－SEA基因最組常組見，占75.3%（389組個(gè)組等組位組基組因）；－α3.7組基組因和－α4.2基因分別占17%（88組個(gè)等位基因）和7.7%（40組個(gè)組等組位組基組因）。并組以－SEA／αα組基組因組型組多組見，占73.2%（345例）；其次為αα／－α3.7基因型，占12.5%（59例）；此外還有－SEA／－α3.7基因型占5.5%（26例），αα／－α4.2基因型占4.2%（20例），－SEA／－α4.2基因型占3.8%（18例），－α3.7／－α4.2組基組因組型組占0.4%（2例），－α3.7／－α3.7基因型占0.2%（1例）。（2）β地貧患兒的基因型和基因頻率：在377例β地貧患兒中檢出11種突變基因，共401個(gè)等位基因，居前5位的突變基因依次組為：CD41－42組占40.2%（161組個(gè)）、IVS－2－654占24.5%（98個(gè)）、CD17占15.5%（62組個(gè)）、β－28占8.5%（34個(gè)）、CD71－72占4.2%（17個(gè)）；其他的突變基因組還組有：CD26（10組個(gè)）、CD43（6組個(gè)）、β－29（5個(gè)）、CD27－28（3組個(gè)）、IVS－1－1（3組個(gè)）、CD14－15（2個(gè)）。共有23組種基因組型，包組括11組種雜合組子（93.6%），分別為：CD41－42（144例）、IVS－2－654（91例）、CD17（53例）、β－28（28例）、CD71－72（13例）、CD26（7例）、CD43（6例）、CD27－28（3例）、β－29（3例）、IVS－1－1（3例）和CD14－15（2例）；9種雙重雜合子（4.5%），分別為：CD41－42／CD26（3例）、IVS－2－654／β－28（3例）、CD41－42／CD17（2例）、CD41－42／CD71－72（2例）、CD41－42／β－28（2例）、IVS－2－654／CD41－42（2例）、CD17／β－29（1例）、CD71－72／β－28（1例）和CD71－72／β－29（1例）；3種純合子（1.9%），分別為：CD17／CD17（3例）、CD41－42／CD41－42（3例）和IVS－2－654／IVS－2－654（1例）。

3 討論

地貧屬于常染色體單基因遺傳性疾病，具有高度的遺傳異質(zhì)性和明顯的地理分布特征。本病臨床表現(xiàn)為不同程度的溶血性貧血，重型患者常出現(xiàn)嚴(yán)重溶血性貧血，往往未成年即已夭折；輕型患者可無(wú)臨床癥狀，極易漏診。因此，有必要開展地貧基因的檢測(cè)和監(jiān)控，指導(dǎo)合理婚配，防止地貧基因蔓延。

本研究對(duì)1 341例血細(xì)胞分析MCV＜82fl兒童進(jìn)行地貧基因檢測(cè)，診斷α地貧471例，檢出率為35.1%，診斷β地貧377例，檢出率為28.1%，α地貧和β地貧檢出率均明顯高于文獻(xiàn)［1－3］報(bào)道。這可能與本資料先通過(guò)對(duì)就診和體檢兒童進(jìn)行血細(xì)胞分析篩查，對(duì)MCV＜82fl者才進(jìn)行地貧基因檢測(cè)，因此導(dǎo)致地貧患兒相對(duì)集中，而檢出率增高。本資料顯示，隨著年齡增長(zhǎng)地貧基因檢出率逐漸增高，學(xué)齡期兒童檢出率達(dá)100%，提示隨著年齡增長(zhǎng)，MCV降低（＜82fl）作為地貧的預(yù)測(cè)指標(biāo)越可靠（P＜0.05）。這主要與嬰幼兒時(shí)期MCV 值降低除受地貧影響外，亦受缺鐵性貧血的影響，幼兒期以后缺鐵性貧血的發(fā)生率顯著下降，因此對(duì)MCV 值的影響也明顯降低，故而推斷MCV＜82fl作為年長(zhǎng)兒地貧的預(yù)測(cè)指標(biāo)較嬰幼兒更可靠。

引起我國(guó)α地貧的基因類型主要有3種：（1）右側(cè)缺失型（－α3.7）；（2）左側(cè)缺失型（－α4.2）；（3）東南亞缺失型（－SEA）。我國(guó)南方以－SEA基因型最常見。本研究471例α地貧患兒基因分析結(jié)果顯示，東南亞缺失型占主導(dǎo)地位，占75.3%，約是－α3.7和－α4.2兩基因總和組的3組倍，右組側(cè)組缺組失組型（－α3.7）是組左組側(cè)組缺組失組型（－α4.2）的2.2倍，與黃鈺君等［4］報(bào)道結(jié)果相似。本地區(qū)兒童α地貧基因型以標(biāo)準(zhǔn)型（－SEA／αα）最為常見（占73.2%），與廣州和珠海等地相似［1，5］。目前，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)34種β地貧突變類型，南方β地貧突變基因型居前5 位的分別是CD41－42，IVS－2－654，β－28，CD17和CD71－72［6］。本研究377例β地貧患兒共檢出11種突變基因類型，與廣州、茂名和南寧等地相似［2，7－8］，高組于組國(guó)組內(nèi)組其組他組地組區(qū)［5，9］。本組資組料組顯組示居前5位突變基因類型占所有檢出的92.9%。共檢出的β組地貧基因型23組種，其中雜合子11組種（93.6%），雙組重組雜組合組子9組種（4.5%），純組合組子3組種（1.9%）。11組種雜合子臨床上均表現(xiàn)為輕型β組地貧，純合子和部分雙重雜合子表現(xiàn)為重型，部分雙重雜合子表現(xiàn)為中間型。

綜上所述，佛山地區(qū)α地貧基因缺失以東南亞缺失型占主導(dǎo)地位，基因型以標(biāo)準(zhǔn)型（－SEA／αα）多見。β地貧以輕型雜合子多見，而重型β地貧較少，主要見于純合子和部分雙重雜合子。地貧是本地區(qū)高發(fā)的地方性遺傳病，有必要對(duì)MCV＜82fl的兒童人群常規(guī)進(jìn)行基因診斷，并建立本地區(qū)的地貧基因網(wǎng)絡(luò)檔案庫(kù)，為計(jì)生部門采取有效措施防止重型地貧患兒的出生和地貧基因的蔓延提供參考依據(jù)。

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