H BsA g抑制漿樣樹突細(xì)胞分泌IF Nα和IL-12

魏萬清 江紅 楊長青 臧國慶 李丹

H BsA g抑制漿樣樹突細(xì)胞分泌IF Nα和IL-12

魏萬清 江紅 楊長青 臧國慶 李丹

目的 體外研究H BsA g對(duì)漿樣樹突細(xì)胞（pD C）功能的影響。方法 磁珠分離健康人外周血pD C，CpG O D N刺激成熟，再給予H BsA g刺激，E LIS A法檢測培養(yǎng)上清中IF Nα和IL-12水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測pD C的表面C D40、C D80、C D83和C D86抗原，激光共聚焦顯微鏡檢測pD C內(nèi)H BsA g的存在情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)所需的pD C細(xì)胞純度≥95%。CpG-O D N2216刺激后，pD C表面C D40、C D80、C D83和C D86抗原的表達(dá)水平分別為78.67±2.04、83.63±3.23、71.82±2.91、70.52±2.22，培養(yǎng)上清中IF Nα和IL-12水平顯著高于對(duì)照組。上述效應(yīng)在加入H BsA g后被顯著抑制。激光共聚焦顯微鏡顯示在pD C細(xì)胞核周圍有H BsA g存在。結(jié)論 H BsA g抑制pD C的成熟和分泌功能。這種作用可能是通過pD C對(duì)H BsA g的內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)。

乙型肝炎病毒表面抗原；漿樣樹突細(xì)胞

H B V感染的控制、轉(zhuǎn)歸及病毒清除，主要取決于宿主的免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對(duì)H B V的耐受狀態(tài)并不是因?yàn)榱馨图?xì)胞功能缺陷，而是由于抗原提呈細(xì)胞功能缺陷，特別是樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，D C）功能缺陷引起，而造成抗原遞呈功能障礙的原因是外界刺激不能誘導(dǎo)D C成熟，H B V本身或者H B V編碼的病毒蛋白都有可能影響抗原提呈細(xì)胞成熟［1-2］。

根據(jù)表型和功能的差別，外周血D C分為2個(gè)亞群，髓樣D C（m D C）和漿樣D C（pD C）兩類。m D C主要發(fā)揮抗原提呈作用，并分泌IL-12，誘導(dǎo)T h0細(xì)胞分化為T h1細(xì)胞，后者產(chǎn)生T h1型細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。pD C是體內(nèi)產(chǎn)生IF Nα的最主要細(xì)胞。越來越多的證據(jù)表明，pD C的數(shù)量和功能狀態(tài)與疾病的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)。

H BsA g大量存在于慢性乙型肝炎患者的肝臟以及血液中，在一些患者體內(nèi)可高達(dá)100μg/m L，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了感染性病毒顆粒［3］，提示其可能在H B V拮抗宿主的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。本研究擬體外證實(shí)H BsA g對(duì)pD C功能的影響。

材料和方法

一、pD C的分離、鑒定及培養(yǎng)

抽取健康人外周血400 m L，用淋巴細(xì)胞分離液得到PB M C。應(yīng)用美天旎公司的pD C磁珠分選系統(tǒng)，進(jìn)行細(xì)胞分選；將得到的細(xì)胞進(jìn)行C D123-P E及B D C A-2-FIT C抗體（B D Bioscience）標(biāo)記，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行陽性細(xì)胞鑒定，證實(shí)分選得到的pD C陽性細(xì)胞純度≥95%。將分選得到的pD C分為4組，即Cp G O D N2216+H BsA g組、Cp G O D N2216組、H BsA g組和PBS組。將各組細(xì)胞在體外培養(yǎng)48 h。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

二、流式細(xì)胞術(shù)檢測pD C的表面抗原

收集、洗滌并重懸4組培養(yǎng)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測C D40、C D80、C D83和C D86的表達(dá)情況。

三、pD C培養(yǎng)上清液中IF N α和IL-12的檢測

收集4組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，應(yīng)用E LIS A法，檢測IF Nα（Invitrogen）和IL-12（R&D System）的表達(dá)。

四、pD C內(nèi)吞H BsA g檢測

收集4組細(xì)胞，加入0.05%TritonX-100，再加入H BsA g一抗及熒光標(biāo)記的二抗及核染料D A PI，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、流式細(xì)胞儀檢測pD C的分離純度

只有得到高純度的pD C細(xì)胞，才使得后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。結(jié)果如圖1所示，分選得到的pD C陽性細(xì)胞純度≥95%。

二、H BsA g抑制pD C活性分子表達(dá)及細(xì)胞因子分泌

流式細(xì)胞儀檢測，新鮮分離的pD C幾乎不表達(dá)C D40、C D80、C D83和C D86等4種細(xì)胞表面抗原。Cp G-O D N2216組中的4種抗原表達(dá)百分比顯著增加，與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cp GO D N2216+H BsA g組中的4種抗原表達(dá)百分比，顯著低于C P G組。見表1。Cp G-O D N2216刺激pD C分泌細(xì)胞因子，這種刺激作用被H BsA g顯著抑制。見圖2。

三、pD C內(nèi)吞H BsA g

如圖3所示，pD C細(xì)胞核周圍有綠色熒光標(biāo)記的H BsA g，提示pD C內(nèi)吞H BsA g。

討 論

pD Cs是體內(nèi)產(chǎn)生IF Nα的最主要細(xì)胞，其分泌的IF N α占PB M C分泌總量的95%以上［4-5］。一旦發(fā)生病毒感染，pD C在受感染部位大量積聚，發(fā)揮強(qiáng)大的抗病毒作用［6-8］。H B V感染時(shí)，亦能見到pD C在肝臟的積聚［9］。國內(nèi)外諸多研究小組關(guān)注D C的生理功能在慢性乙型肝炎（C H B）狀態(tài)下發(fā)生的改變。目前對(duì)C H B患者外周血中D C亞群的頻數(shù)是否改變還存在爭議，但一致認(rèn)為D C亞群的功能在C H B狀態(tài)下受損［10-12］。C H B患者外周血m D C頻數(shù)與血清A L T水平、病毒載量呈負(fù)相關(guān)［13］；經(jīng)L A M抗病毒治療后，pD C數(shù)量回升［14］。

H B V感染如何導(dǎo)致D C功能受損機(jī)制并不甚清楚。一些病毒，如HIV［15］、H C V［16］等，能夠通過自身結(jié)構(gòu)蛋白抑制pD C的功能來發(fā)揮拮抗宿主免疫清除效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞源性的D C能攝取H B V抗原，但不支持H B V進(jìn)入細(xì)胞核，提示H B V不能在D C內(nèi)復(fù)制，H B V蛋白可能是干擾D C功能的因素［17］。m D C能夠吞噬H BsA g，在m D C成熟過程中如果存在H BsA g或者完整病毒顆粒導(dǎo)致m D C表面共刺激分子的表達(dá)降低，不能有效地刺激T淋巴細(xì)胞的增殖和分泌細(xì)胞因子，這些結(jié)果表明H B V完整病毒顆?；騂 BsA g具有免疫調(diào)節(jié)能力，可以直接導(dǎo)致慢性H B V感染的患者m D C功能失調(diào)［18］。這些研究結(jié)果提示，C H B患者D C的功能受損并不依賴于H B V復(fù)制，而可能與H B V的結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，盡管H BcA g的免疫原性最強(qiáng)，但在機(jī)體內(nèi)主要是通過B細(xì)胞而非D C進(jìn)行抗原提呈［19-20］；且D C不能攝取外源性H BcA g，在機(jī)體內(nèi)是以H BcA g/抗-H Bc免疫復(fù)合體的形式被D C提呈［20］。研究還發(fā)現(xiàn)，盡管H BcA g、不同截?cái)囿wH BcA g及H BeA g能夠在體外刺激H E K293細(xì)胞上的T L R信號(hào)通路，但H Bc/ H BeA g蛋白不是人T L R的配體，不能激活人T L R信號(hào)通路［20］。

本研究顯示，H BsA g存在條件下，pD C表面分子表達(dá)減弱，分泌IF N α和IL-12水平降低。IL-12能幫助C T L清除受感染的肝細(xì)胞，并且上調(diào)IF Nα水平。Cp G-O D N2216刺激pD C分泌IF N α和IL-12的效應(yīng)能被H BsA g抑制，提示H BsA g干擾pD C免疫功能。這種作用可能是通過pD C對(duì)H BsA g的內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)。H BsA g抑制pD C功能的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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H BsAg inhibits secretion of interferon-α and interleukin-12 from plasmacytoid dendritic cells

W EI W an-qing，JIA N G H ong，Y A N G Chang-qing，Z A N G Guo-qing，LI D an. Department ofDigestion，Tongji H ospital of Shanghai，Shanghai200065，China

Objective To investigate the effect of H BsA g on function of plasmacytoid dendritic cells（pD C）in vitro.M ethods pD Cs，sorted by im m uno magnetic beads，were divided into four groups：control group（incubated with PBS），H BsA g group（stim ulated by H BsA g），CpG-O D N group（stim ulated by CpG-O D N2216）and CpG-O D N/H BsA g group（stim ulated by CpG-O D N2216 and H BsA g）.Cytokines in the cell supernatant were measured by enzy me-linked im m une sorbent assay.Surface markers were analyzed by flow cyto metry，and endocytosis of H BsA g into cytoplasma of pD Cs was imaged by confocal microscope.Results The purity of pD Cs was m ore than 95%.The freshly isolated pD Cs expressed very low levels of cell surface markers（C D40，C D80，C D83，C D86），w hich was upregulated by CpGO D N2216 but dow nregulated by H BsA g.Activated pD Cs stim ulated by CpG-O D N2216 secreted high levels ofinterferon alpha and interleukin 6，w hich could be inhibited by H BsA g.In im m unofluorescence pictures，Green H BsA g was localized in pD Cs cytoplasm and accu m ulated around cell nucleus.Conclusion H BsA g causes the defects of pD Cs im m une functions，w hich might be achieved through the endocytosis of H BsA g by pD Cs.

H epatitis B surface antigen；Plasmacytoid dendritic cells

2014-10-24）

（本文編輯：錢燕）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81102279）

200001 上海市同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科（魏萬清，楊長青）；上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院感染科（江紅，臧國慶，李丹）