肝衰竭患者外周血單核細(xì)胞H L A-D R的表達(dá)

李慶彥 劉晶晶 李慶方

肝衰竭患者外周血單核細(xì)胞H L A-D R的表達(dá)

李慶彥 劉晶晶 李慶方

目的 探討不同病因所致肝衰竭患者外周血單核細(xì)胞H L A-D R基因m R N A表達(dá)及其意義。方法 隨機(jī)選取肝衰竭患者40例，其中嗜肝病毒感染10例、藥物性肝損傷10例、酒精性肝損傷10例、自身免疫性肝病10例。10名健康對(duì)照為本院健康志愿者。應(yīng)用R T-PC R法檢測(cè)各組患者外周血單核細(xì)胞H L A-D R基因m R N A表達(dá)，并動(dòng)態(tài)觀察H L A-D R基因m R N A表達(dá)的變化，及其與病程發(fā)展及臨床癥狀的關(guān)系。結(jié)果 R T-PC R結(jié)果顯示，嗜肝病毒感染組、正常對(duì)照組、藥物損傷組、酒精損傷組、自身免疫組H L A-D R基因m R N A表達(dá)分別為137.51±5.22、18.14±1.29、19.64±2.03、11.25±1.22、26.61±2.31，且呈逐漸降低趨勢(shì)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)不同病因組患者單核細(xì)胞H L A-D R m R N A表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，17例死亡患者H L A-D R m R N A表達(dá)持續(xù)下降直至患者死亡；另外23例患者，經(jīng)治療各組H L A-D R m R N A表達(dá)逐漸恢復(fù)至接近正常水平，臨床癥狀同步改善。結(jié)論 外周血單核細(xì)胞H L A-D R m R N A表達(dá)與肝衰竭的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

肝衰竭；H L A-D R；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

肝衰竭是指在多種致病因素作用下，肝細(xì)胞缺血、缺氧性壞死和凋亡，肝臟發(fā)生大塊壞死或者亞大塊壞死的綜合征［1］。

在肝衰竭形成的過程中，單核/吞噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。單核/巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，是機(jī)體防御病原性異物侵襲的第一道防線，也是聯(lián)系固有免疫和特異性免疫應(yīng)答的重要媒介。單核細(xì)胞可活化為巨噬細(xì)胞，通過吞噬、廓清抗原，清除異物，并可通過分泌細(xì)胞因子引起炎性反應(yīng)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞還是專職抗原提呈細(xì)胞，通過M H C-II類分子與抗原肽結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面供T淋巴細(xì)胞識(shí)別，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞M H CII類分子表達(dá)高低與抗原提成功能強(qiáng)弱呈正相關(guān)。

H L A-D R是重要的M H C-II類分子，單核細(xì)胞表面H L A-D R表達(dá)水平可反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。H L A-D R可在單核細(xì)胞接受外來刺激活化后表達(dá)上升，但在嚴(yán)重疾病狀態(tài)下，如膿毒血癥、重癥胰腺炎等，可出現(xiàn)顯著下降，呈免疫麻痹狀態(tài)。Lin等［2］報(bào)道Child C級(jí)肝硬化患者單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)低于健康對(duì)照組，采用脂多糖體外刺激H L A-D R低表達(dá)單核細(xì)胞，T N F-α分泌量顯著下降。Berres等［3］通過對(duì)肝硬化患者單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)特點(diǎn)的隨訪發(fā)現(xiàn)，重癥監(jiān)護(hù)的肝硬化患者中，存活者單核細(xì)胞表達(dá)H L A-D R穩(wěn)定或者升高，而H L A-D R表達(dá)持續(xù)下降者預(yù)后不良。Berry等［4］也證實(shí)失代償期肝硬化單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)低于40%預(yù)后較差。

本研究觀察不同病因所致肝衰竭患者外周血單核細(xì)胞H L A-D R m R N A的表達(dá)特點(diǎn)，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

資料和方法

一、研究對(duì)象

隨機(jī)選取2010年至2014年山東聊城市人民醫(yī)院肝衰竭患者40例，其中嗜肝病毒感染10例、藥物性肝損傷10例、酒精性肝損傷10例、自身免疫性肝病10例；10名健康對(duì)照為本院健康志愿者。

二、熒光定量R T-P C R引物及探針

H L A-D R引物及探針由上海斯丹賽生物工程有限公司合成、標(biāo)記。其中在探針5′端標(biāo)記上熒光報(bào)道基團(tuán)F A M（6-carboxy-fluores-cein），3′端標(biāo)記上熒光淬滅基團(tuán)TA M R A（6-carboxy-tetramethy-rhodamine）。

三、標(biāo)本采集

入組患者分別于入院第1、4、8、12、16、20天采集靜脈血3 m L，動(dòng)態(tài)檢測(cè)H L A-D R m R N A表達(dá)，并分析其與臨床癥狀變化的關(guān)系。

R N A的提取與定量：分離培養(yǎng)單核細(xì)胞，洗脫收集細(xì)胞備用。用無R N A酶的雙蒸水配制的PBS洗滌，應(yīng)用T RIzol提取各組總R N A，方法按試劑說明書進(jìn)行。所提取的總R N A用紫外分光光度計(jì)定量，A260 n m/A280 n m≥1.8，總R N A完整性經(jīng)瓊脂糖電泳，可見明顯的28S、18S兩條帶。

四、cD N A合成

按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，20μL體系中含總R N A 1μg、4μLM gS O4（25m m ol/L），2×Bcalst Buffer 10μL，1.5μL R Nase Free H2O，10 m m ol/L d N T PMixture，1μLOliogo dT Primer，0.5 μL Rnase Inhibitor（40 U/μL），1μL BcaBest Poly merase （22 U/μL）65℃1 min，30℃5 min，65℃30 min，98℃5 min，5℃5 min，合成好的cD N A置-20℃保存待測(cè)。

五、實(shí)時(shí)熒光定量P C R

（一）構(gòu)建載體 用T-A載體克隆法，將635 bp H L A-D R擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pG E M-Teasy載體，用質(zhì)粒D N A試劑盒提取質(zhì)粒D N A，紫外分光光度計(jì)定量，稀釋成不同的濃度梯度作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。

（二）P C R 在50μL體系中含1×Taq man緩沖液，3.5 m m ol/L M gCl2，200μm ol/L d A T P、dC T P和dG T P，400μm ol/L d U T P，1.25 U a m pilTaq Gold，0.5 UA m p Erase U N G，H L A-D R上下游引物各0.3μm ol/L，熒光探針20 n m ol/L，100 ng R N A反轉(zhuǎn)錄得到的cD N A或不同濃度的定量模板。

（三）P C R條件 50℃2 min，95℃10 min，然后95℃15 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均做3個(gè)平行管，P C R結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自動(dòng)進(jìn)行分析，算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組單核細(xì)胞H L A-D R m R N A表達(dá)

單核細(xì)胞H L A-D R m R N A表達(dá)水平在嗜肝病毒感染組為137.51±5.22、藥物性肝損傷組為（18.14± 1.29）、酒精性肝損傷組為（19.64±2.03）、自身免疫性肝病組為（11.25±1.22）、健康對(duì)照組為（26.61± 2.31）。

二、各組患者單核細(xì)胞H L A-D R m R N A表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果

17例病情逐步加重并死亡患者（其中嗜肝病毒感染組5例、藥物損傷組3例、酒精損傷組2例、自身免疫組7例）隨著病情的發(fā)展，雖然臨床進(jìn)行積極救治，但H L A-D R m R N A表達(dá)仍未改善并持續(xù)下降直至死亡；23例存活患者病情逐步好轉(zhuǎn)，經(jīng)治療各組H L AD R m R N A表達(dá)逐漸恢復(fù)至接近正常水平，臨床癥狀同步改善。各組死亡患者和存活患者H L A-D R m R N A動(dòng)態(tài)水平見表1，表2。

表1 各組死亡患者單核細(xì)胞H L A-D R m R N A動(dòng)態(tài)表達(dá)水平（±s）

表2 各組存活患者單核細(xì)胞H L A-D R m R N A動(dòng)態(tài)表達(dá)水平（±s）

討 論

H L A-D R是單核細(xì)胞重要的活化標(biāo)志，也是單核細(xì)胞表達(dá)的功能性分子，因而單核細(xì)胞表面H L A-D R表達(dá)水平的高低可反映單核細(xì)胞的功能狀態(tài)。有研究表明，內(nèi)毒素血癥引起單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)下調(diào)［5-7］。肝硬化患者單核免疫功能麻痹不僅與單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)下降有關(guān)，而且與單核細(xì)胞的功能相關(guān)；失代償期肝硬化單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)低于40%預(yù)后較差［2-3］。V olk等［8］認(rèn)為C D14陽性單核細(xì)胞H L A-D R水平是判斷膿毒癥免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，以表達(dá)水平＜30%作為閾值可篩選出處于免疫抑制狀態(tài)的患者，對(duì)這些患者進(jìn)行免疫刺激可有效逆轉(zhuǎn)免疫抑制或改善預(yù)后。因此，H L A-D R的表達(dá)率是判斷肝衰竭患者是否合并免疫抑制的重要指標(biāo)，且與不良預(yù)后密切相關(guān)［9］。

嗜肝病毒感染損傷肝細(xì)胞的機(jī)制尚未完全清楚，既往認(rèn)為過強(qiáng)的免疫反應(yīng)是嗜肝病毒感染性肝衰竭發(fā)生的主要因素，以細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫是造成細(xì)胞凋亡和壞死的主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，入院時(shí)嗜肝病毒感染組H L A-D R m R N A表達(dá)顯著高于其他病因組及正常對(duì)照組，可能與過強(qiáng)的免疫反應(yīng)相關(guān)。藥物性肝損傷及酒精性肝損傷組因長(zhǎng)期的藥物及酒精蓄積引起機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂，免疫抑制，本研究中藥物性肝損傷組及酒精性肝損傷組H L A-D R m R N A表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組可能與此相關(guān)。自身免疫性肝病組因機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身肝細(xì)胞抗原成分是耐受，產(chǎn)生自身抗體及自身反應(yīng)性T細(xì)胞所致，可能因長(zhǎng)期的免疫耐受，導(dǎo)致H L A-D R m R N A表達(dá)顯著降低。

對(duì)不同病因患者H L A-D R m R N A表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，17例死亡者H L A-D R m R N A表達(dá)持續(xù)低下，而23例存活者，隨癥狀改善H L A-D R m R N A表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，直至恢復(fù)至接近正常水平。該結(jié)果提示，H L A-D R m R N A表達(dá)與不同病因肝功能衰竭的臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后密切相關(guān)。研究顯示，當(dāng)H L AD R m R N A表達(dá)顯著降低時(shí)，患者可能存在嚴(yán)重的免疫抑制，臨床應(yīng)考慮采用免疫治療措施［10-11］。本研究動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果顯示，將H L A-D R m R N A表達(dá)作為肝衰竭重癥的判斷閾值是可靠的，H L A-D R m R N A表達(dá)不僅是評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)，也可作為肝衰竭的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。

本研究提示，單核細(xì)胞H L A-D R m R N A表達(dá)能反映不同病因肝衰竭，尤其是重癥患者機(jī)體免疫抑制狀況，可作為預(yù)測(cè)預(yù)后及指導(dǎo)免疫刺激治療的一項(xiàng)敏感而有效的指標(biāo)；動(dòng)態(tài)觀察單核細(xì)胞H L A-D R表達(dá)率可監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展及對(duì)預(yù)后作出正確評(píng)估。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂.病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志，2001，19：56-62.

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4 Berry P A，Antoniades CG，Carey I，et al.Severity of the compensatory anti-infla m matory response determined by m onocyte H L A-D R expression may assist outco me prediction in cirrhosis.Intensive Care M ed，2011，37：453-460.

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8 V okl H D，Reink P，Krausch D，et al.M onocyte deactivation rationale for a new therapeutic stratery in sepsis.Intensive Care M ed，1996，22：474-481.

9 A beles R D，M cPhail M J，Sowter D，et al.C D14，C D16 and H L AD R reliably identifies hu man m onocytes and their subsets in the context of pathologically reduced H L A-D R expression by C D14（hi）/C D16（neg）m onocytes：Expansion of C D14（hi）/C D16（pos）and contraction of C D14（lo）/C D16（pos）m onocytes in acute liver failure.Cyto metry，2012，81：823-834.

10 林洪遠(yuǎn)，郭旭生，姚詠明，等.C D+14單核細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原-D R預(yù)測(cè)膿毒癥預(yù)后及指導(dǎo)免疫調(diào)理治療的初步臨床研究.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2003，15：135-138.

11 蘇磊，孟繁甦，唐柚青，等.創(chuàng)傷膿毒癥患者免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)及烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1行免疫調(diào)理的臨床研究.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，11：1366-1368.

Expression of H L A-D R m R N A from peripheral blood mononuclear cells in patients with liver failure

LI Qing-yan，E m ail：sdliqingy73@163.com

Objective To investigate the H L A-D Rm R N A expression fro m peripheral blood m ononuclear cells （PB M Cs）of liver failure patients with different pathogenesis.M ethods Forty patients with liver failure fro m 2010 to 2014 in our hospital were enrolled and divided into 4 groups according to pathogenesis.M ean w hile，10 persons undergoing health examination were involved as control.Expression of H L A-D R m R N A fro m PB M Cs was detected by real time-poly merase chain reaction（R T-PC R）at day 1，4，8，12，16，20 after hospitalization，to analyze its relevance with liver failure progress and clinical sy m pto ms.Results There was significant difference in H L A-D R m R N A expressions am ong 4 groups.The level of H L A-D R m R N A decreased continuously without amelioration in 17 died patients，w hile thatincreased gradually to normallevel with sy m pto m im proved in other 23 survived patients.ConclusionExpression of H L A-D R m R N A fro m PB M Cs is closely related to severity of liver failure，w hich might be a valuable parameter to evaluate severity and prognosis of liver failure in clinic practice.

Liver failure；H L A-D R；R T-PC R

2014-10-24）

（本文編輯：錢燕）

252000 山東省聊城市人民醫(yī)院感染病科

李慶彥，E mail：sdliqingy73@163.co m

LI Qing-yan，LIU Jing-jing，LI Qing-fang. Department of Infectious Disease Liaocheng People′s H ospital，Shandong252000，China