間充質(zhì)干細(xì)胞治療晚期脂肪性肝病的研究進(jìn)展

陳 怡

肝病至今仍是五大致死性疾病之一，其中脂肪性肝病現(xiàn)已取代病毒性肝病成為全球第一大類肝病，由脂肪性肝病發(fā)展為肝硬化或重癥肝病的患者不斷增多。無論急性或慢性脂肪性肝病、酒精性或非酒精性脂肪性肝病、營養(yǎng)不良性或營養(yǎng)過剩性脂肪性肝病，均可引起大量肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)肝纖維化，最后導(dǎo)致不可逆的肝衰竭。而且脂肪性肝病早期多無臨床癥狀，易被忽視，晚期只能行肝移植。由于肝移植器官來源緊缺、有免疫排斥、費用昂貴且涉及倫理道德，故肝移植的普及是很困難的。利用間充質(zhì)干細(xì)胞的高度增殖和分化潛能，細(xì)胞治療作為一種替代治療手段應(yīng)運而生［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，由于會導(dǎo)致腫瘤，其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)格限制［2］，外源性骨髓［3］、脂肪［4］、臍血［5］是常用的細(xì)胞治療用間充質(zhì)干細(xì)胞的來源。本文著重闡述不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)成類肝細(xì)胞以治療晚期脂肪性肝病的研究進(jìn)展。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞的來源和治療潛能

1.1 骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）來源于中胚層，具有自我復(fù)制、高度增殖和多向分化潛能，能夠被定向分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、韌帶和肌細(xì)胞譜系［6］。BMSC表面陽性表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49e、CD51、CD54、CD59、CD71，不表達(dá) CD34、CD45、CD14、CD79。有動物實驗發(fā)現(xiàn)，BMSC與表皮生長因子-4（EGF-4）、EGF-1α、肝細(xì)胞生長因子（HGF）及CK18等培養(yǎng)7 d后，BMSC表達(dá)了肝細(xì)胞核因子-3β（HNF-3β，F(xiàn)OXA2）、GATA4、CK19、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、AFP；14～28 d后，表達(dá)CK18、HNF-4、EGF-1α的細(xì)胞都表現(xiàn)出肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征，能分泌尿素、白蛋白和細(xì)胞色素P450，產(chǎn)生低密度脂蛋白和儲存糖原［7］。因此，BMSC是一種理想的肝損傷和生物人工肝治療的干細(xì)胞來源。

1.2 脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪干細(xì)胞（ADSC）是來源于脂肪，具有自我更新和分化誘導(dǎo)能力，并呈現(xiàn)出干細(xì)胞特征的一群細(xì)胞。由于其來源易得，在體外有可能增殖成許多自體同源細(xì)胞，因此其用于細(xì)胞治療和組織工程受到廣泛關(guān)注。ADSC與BMSC的表面標(biāo)志物表達(dá)相同、增殖潛能相似并可能前者更好［8］。

1.3 臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞

臍血干細(xì)胞來源于臍血，其許多成分是多能干細(xì)胞，表面標(biāo)志物表達(dá)與BMSC相同，能分化產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞。此外，臍血干細(xì)胞也表達(dá)胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如 Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-1、SSEA-4、OCT-4［9］。因其低水平表達(dá)人類白細(xì)胞抗原-ABC（HLA-ABC），不表達(dá) HLA-DR，分泌的分子能誘導(dǎo)自然殺傷（NK）細(xì)胞，并能抑制T細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和干擾素-γ（IFN-γ）［10］，因此臍血干細(xì)胞能夠從內(nèi)胚層、中胚層直到外胚層進(jìn)行擴(kuò)展。

臍血干細(xì)胞首先被從其他干細(xì)胞中分離鑒定出來，它們表達(dá)干細(xì)胞的受體CD44、CD105、CD90和CD73［11］，但不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志物CD31、CD34、HLA-DR和CD45，而且它們能分化成心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞。

有研究指出，肝外的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠采用2D或3D的肝細(xì)胞共培養(yǎng)方式，通過外援性生長因子的刺激誘導(dǎo)為肝細(xì)胞［12］。Zhang等［13］用兩步法將臍血干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，采用的肝細(xì)胞生長因子包括HGF、成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、地塞米松、胰島素等。

上述研究表明，在合適的外環(huán)境和條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為肝細(xì)胞，是晚期脂肪性肝病細(xì)胞治療和肝臟組織工程的有效來源，而不同來源的干細(xì)胞具有不同的功能［14］，在小鼠模型和人類的應(yīng)用中都值得作進(jìn)一步研究。

2 脂肪肝的肝損傷及間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)的機(jī)制

酒精性肝病和非酒精性肝病是根據(jù)每日飲酒量來劃分的［15］，最終的結(jié)果都是導(dǎo)致肝纖維化和肝損傷。在酒精性脂肪性肝病中，乙醇可使肝細(xì)胞發(fā)生很大的改變，包括質(zhì)膜、線粒體和細(xì)胞核［16］。在質(zhì)膜中，乙醇可增加膜的通透性，誘導(dǎo)膜缺陷發(fā)生，引起磷脂的數(shù)量增加，增加膜表面電荷密度和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物；特別是最近鑒定出了包括annexin A3和annexin A6在內(nèi)的5種蛋白可作為乙醇導(dǎo)致肝硬化的相關(guān)生物標(biāo)志物。在高脂飲食小鼠模型中，高脂飲食可引起三酰甘油和膽固醇升高，導(dǎo)致血脂異常、脂質(zhì)過氧化和肝星狀細(xì)胞的激活，最終導(dǎo)致肝脂肪變［17］。肝細(xì)胞的胰島素抵抗，更加速了炎性反應(yīng)的進(jìn)程。

研究表明，干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦渭?xì)胞主要是通過兩種可能的機(jī)制：轉(zhuǎn)移分化和細(xì)胞融合［18］。首先，在間充質(zhì)干細(xì)胞被注射入肝臟后，發(fā)生同型轉(zhuǎn)變，表達(dá)類肝細(xì)胞的基因型，完成肝細(xì)胞類似的新陳代謝功能表達(dá)。但只有8%～23%的間充質(zhì)干細(xì)胞實現(xiàn)了向肝細(xì)胞的定向分化［19］，其機(jī)制不明。其次，肝損傷與免疫細(xì)胞浸潤引起的持續(xù)性炎性反應(yīng)有關(guān)［20］，而間充質(zhì)干細(xì)胞有免疫誘導(dǎo)特性，能分泌抗炎因子，下調(diào)T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤［21］。再次，輸注間充質(zhì)干細(xì)胞可降低血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）、TGF-β1，出現(xiàn)膠原蛋白減少，表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-13、MMP-14等，激活溶酶原激活因子，實現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)［22］。最后，移植間充質(zhì)干細(xì)胞可導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞凋亡，并通過分泌肝損傷修復(fù)過程中的生長因子和細(xì)胞因子來促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，最終促進(jìn)已纖維化的肝臟容量提升。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肝臟的應(yīng)用現(xiàn)狀

有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞治療晚期脂肪性肝病的研究不多。Kharaziha等［23］對包括酒精性肝病在內(nèi)的8例終末期肝病患者進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞治療。先從患者髂嵴處抽取脂肪進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖自體間充質(zhì)干細(xì)胞，再通過外周靜脈和門靜脈輸注3×108～5×108干細(xì)胞，分別于注射后第1、2、4、8及24周評估療效。結(jié)果顯示，患者對間充質(zhì)干細(xì)胞移植耐受，MELD 評分指數(shù)從（17.9±5.6）下降到（10.7±6.3）（P＜0.05），凝血酶原復(fù)合物指數(shù)從（1.9±0.4）下降到（1.4±0.5）（P＜0.05），血清肌酸酐從（114±35）mmol／L下降到（80±18）mmol／L（P＜0.05），血清白蛋白從（30±5）g／L上升到（33±5）g／L，膽紅素從（46±29）mmol／L下降到（41±31）mmol／L，沒有任何不良反應(yīng)發(fā)生。

用BMSC和ADSC治療非酒精性脂肪性肝病的具體操作方法已有報道［24］。Pelz等［25］對蛋氨酸／膽堿缺陷飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型輸注干細(xì)胞，結(jié)果移植后短期和長期的療效觀察都顯示間充質(zhì)干細(xì)胞能在肝內(nèi)定居并表現(xiàn)出肝細(xì)胞功能。

在用間充質(zhì)干細(xì)胞治療時，通常不需要考慮免疫配型、組織相容性抗原（MHC）的匹配和防止免疫拮抗反應(yīng)等問題。由于間充質(zhì)干細(xì)胞不含MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86和CD40，不會引起同型T細(xì)胞反應(yīng)，間充質(zhì)干細(xì)胞不是宿主免疫識別的對象［26］，因此其能免受宿主免疫細(xì)胞的攻擊。有研究報道小鼠經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞治療后，抗炎因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）、IL-15受體等上調(diào)，促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6等下調(diào)［27］。

在骨髓、脂肪、臍血等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞注射入肝臟后，可通過血清膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平對效果進(jìn)行臨床評估［28］。Kuo等［29］的研究認(rèn)為，經(jīng)脾注射和經(jīng)靜脈注射都有助于肝細(xì)胞增加及肝臟修復(fù)，但后者比前者更有效，受體的氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕能促進(jìn)肝損傷后肝細(xì)胞的復(fù)原，提示有旁分泌作用的影響。Adriana等［28］的研究分別將BMSC和安慰劑由門靜脈注入用四氯化碳（CCl4）損傷的肝臟中，檢測ALT、AST和白蛋白水平，發(fā)現(xiàn)BMSC并不能減輕纖維化、改善肝功能。由于大部分?jǐn)?shù)據(jù)來自小樣本非隨機(jī)對照研究，故需進(jìn)一步的研究以確定在終末期肝硬化患者中，細(xì)胞療法的作用以及哪種類型患者應(yīng)用細(xì)胞治療的效果最好，哪種細(xì)胞類型治療最安全有效。

4 展望

采用MSC治療脂肪性肝病引起的肝損傷的優(yōu)勢是：避免了倫理之爭；移植痛苦小，不良反應(yīng)少，不易引起感染；病程較短，從采集到干細(xì)胞培養(yǎng)、純化，再到回輸至患者體內(nèi)，只需要很短的時間；間充質(zhì)干細(xì)胞移植費用比肝移植低很多；有一定的療效，安全性高，避免了異體移植引起的感染和腫瘤形成風(fēng)險，避免了異體基因引起的遺傳病和異體蛋白所致免疫排斥反應(yīng)。

目前間充質(zhì)干細(xì)胞的治療研究仍是初步的，許多問題亟需解決，包括注入的細(xì)胞數(shù)量、成分、劑量，移植的最佳時機(jī)及治療的管理方式等。同時，如何保持間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增后的特性，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制是通過哪些途徑來實現(xiàn)的，怎樣能避免間充質(zhì)干細(xì)胞移植后修復(fù)肝損傷的不良作用，都將是今后需要研究的方向。此外，通過建立患者自體骨髓庫、羊水干細(xì)胞庫及自體脂肪體外培養(yǎng)的方法，找到安全、有效、易得的干細(xì)胞來源，并實現(xiàn)自體細(xì)胞移植，將大大拓展脂肪性肝病所致的晚期肝損傷的治療方法。

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