酒精性肝纖維化中主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

姜艷紅 張維東

酒精性肝?。ˋLD）是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可進(jìn)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化（ALF）、酒精性肝硬化甚至可引起肝功能衰竭。ALD的進(jìn)展過程中，乙醇在體內(nèi)代謝通過多個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生氧自由基（ROS），ROS作用于生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化形成過氧化脂（LPO），LPO可通過誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)而誘導(dǎo)HSC活化增殖。乙醛是乙醇的中間代謝物，能觸發(fā)多種復(fù)雜的反應(yīng)，可以使細(xì)胞基質(zhì)分泌增多并激活HSC，從而導(dǎo)致ALF的發(fā)生。因ALF早期具有可逆轉(zhuǎn)的特點(diǎn)，所以對(duì)發(fā)生機(jī)制的深入研究一直是近年來的熱點(diǎn)。

研究表明，HSC的活化和增殖在肝纖維化的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用［1］，活化的HSC表達(dá)多種細(xì)胞外信號(hào)通路蛋白，產(chǎn)生以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和細(xì)胞因子。HSC活化的標(biāo)志物包括平滑肌肌動(dòng)蛋白-α（α-SMA）、原膠原Ⅰ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）和組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）等。經(jīng)過乙醛處理后，膠原蛋白Ⅰ的合成增加，而在HSC中其降解減少，在肝臟中的膠原蛋白和膠原蛋白基因產(chǎn)生高效表達(dá)。有研究表明，早期依賴乙醛的反應(yīng)可引發(fā)后期的肝纖維化［2］。

了解參與HSC活化增殖凋亡的相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可為逆轉(zhuǎn)ALF提供有效的靶向。本文簡(jiǎn)要綜述了ALF主要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 TGF-β／Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TGF-β是一種參與細(xì)胞存活、增殖、分化、血管生成和傷口愈合應(yīng)答的多效性細(xì)胞因子［3-4］。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2四個(gè)亞型。許多細(xì)胞表面都有TGF-β受體（TGF-βR）表達(dá)，其具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種形式。TGF-βRⅠ、Ⅱ型均為糖蛋白，它們與 TGF-β1的親和力是與TGF-β2的親和力的10～80倍，Ⅲ型受體則是一種與 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三者的親和力相近的蛋白聚糖，是TGF-β主要的受體，可能在TGF-β發(fā)揮生物學(xué)功能中起著重要作用。TGF-βRⅢ的主要配體是 TGF-β1和 TGF-β3。

Smads蛋白家族在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起著主要作用，在保守的結(jié)構(gòu)域MH1和MH2之間有中間連接區(qū)域。每個(gè)Smad蛋白介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad2和Smad3參與TGF-β活化素信號(hào)途徑，Smad4的MH1結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活和定位功能，而Smad6和Smad7是TGF-β／Smads信號(hào)通路的抑制分子。在Smad蛋白依賴的信號(hào)中，TGF-β1和Ras相關(guān)激酶使Smad2和Smad3差異磷酸化，從而建立羧基末端（C）、鏈接器（L）或雙重（L／C）磷酸化異構(gòu)體，磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4基因移位到細(xì)胞核內(nèi)，激活或抑制它們所調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。

研究表明，細(xì)胞凋亡、免疫清除、表型逆轉(zhuǎn)和細(xì)胞衰老參與清除活化的HSC或抑制HSC激活，可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化［5］。慢性肝病中TGF-β通過炎性反應(yīng)促進(jìn)纖維發(fā)生，是較有力的促進(jìn)因素［6-7］。HSC的激活和纖維化的進(jìn)展與 TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3a、Smad3b等表達(dá)上調(diào)有關(guān)［8］。在小鼠和大鼠的HSC中采用細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)以及RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法分析、免疫組化染色、流式細(xì)胞技術(shù)等方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1上調(diào)血小板衍生生長(zhǎng)因子-β（PDGF-β）受體mRNA的表達(dá)并明顯誘導(dǎo)HSC增殖，且依賴TGF-β1的HSC增殖是由過氧化氫酶抑制的過氧化氫作用的，即PDGF-β受體通過激活PI3K／AKT／P70（S6K）信號(hào)通路影響TGF-β1的作用并通過 ROS介導(dǎo)［9］。Tang等［10］體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鱉甲提取肽（CTEP）可影響TGF-β1誘導(dǎo)的HSC，應(yīng)用MTS試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡法可知，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TIMP-1的含量顯著被抑制，經(jīng)CTEP處理后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、p-Smad3、TIMP-1和α-SMA的蛋白顯著降低，而Smad3蛋白的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示通過TGF-β1／Smads通路以及消除ECM能有效抑制培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞的活化和增殖。在肝纖維化中TGF-β／Smads信號(hào)通路的作用機(jī)制已較明確，而此通路在ALF中同樣發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)乙醛可以使HSC中的TGF-β信號(hào)通路激活，TGF-β1抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白及纖維黏連素增加，導(dǎo)致HSC增殖并轉(zhuǎn)分化，而TGF-β信號(hào)可以通過下調(diào)乙醇脫氫酶1增加肝臟脂質(zhì)的堆積［11］。也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以作用于ROS生成和鈣內(nèi)流，而這兩者是調(diào)節(jié)HSC的活化劑。TGF-β1介導(dǎo)氧化應(yīng)激引起HSC的轉(zhuǎn)分化，為ECM沉積和疤痕收縮做好準(zhǔn)備，致使ECM和Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生。從桑黃菌絲體中分離出的一種視黃酸衍生物可下調(diào)TGF-β1／PDGF刺激的HSCT6細(xì)胞中ROS生成和鈣內(nèi)流，逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化［12-13］。Smad7是TGF-β信號(hào)通路的細(xì)胞內(nèi)的負(fù)調(diào)節(jié)物，在乙醇引起的肝損傷過程中，調(diào)控脂肪生成和炎性反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)，肌成纖維細(xì)胞中TGF-β能傳遞引起纖維化的pSmad2 L／C與促有絲分裂的pSmad3 L信號(hào)，因?yàn)镾mad7不能被pSmad3 L信號(hào)途徑誘導(dǎo)，Smad7缺失加劇，缺乏Smad7的肝細(xì)胞里TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化加快且乙醇脫氫酶表達(dá)顯著降低，缺少Smad7可能導(dǎo)致 ALF加速［14-15］。

2 Wnt／β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Wnt是一類通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用的糖蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)主要有 Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等19種蛋白。其信號(hào)通路的核心蛋白為一種多功能的蛋白質(zhì)β-連環(huán)蛋白（β-catenin），在細(xì)胞連接處與鈣黏素相互作用而形成粘合帶。游離的β-catenin能進(jìn)入細(xì)胞核參與基因表達(dá)。β-catenin降解復(fù)合體主要由結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋPC）基因蛋白、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、支架蛋白Axin組成。Wnt信號(hào)通路包括Wnt經(jīng)典信號(hào)通路和Wnt非經(jīng)典信號(hào)通路。經(jīng)典途徑受到激活后，胞外的 Wnt蛋白與其細(xì)胞表面受體Frizzled以及LRP跨膜受體結(jié)合成復(fù)合體，通過活化的蓬亂蛋白（Disheveled，又稱Dsh或Dvl）激活下游因子GSK-3β結(jié)合蛋白（GBP），GBP識(shí)別并抑制GSK-3β的活性，從而影響β-catenin絲氨酸及蘇氨酸的磷酸化及降解，阻止β-catenin降解復(fù)合體的形成，導(dǎo)致β-catenin在胞漿內(nèi)蓄積并進(jìn)入核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子LEF／TCF結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活某些特定基因的表達(dá)［16-18］。

Wnt／β-catenin信號(hào)通路與TGF-β信號(hào)通路、miRNA之間在參與肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化和腎纖維化等各器官相關(guān)的致病作用中存在著信號(hào)串話［19］。激活HSC后，Wnt信號(hào)途徑中某些元素被上調(diào)［20］。但是此通路在ALF中的作用機(jī)制目前還未被完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，在ALF中利用肌成纖維細(xì)胞基于Cre-loxP的遺傳標(biāo)志物，在肝纖維化復(fù)原過程中，半數(shù)肌成纖維細(xì)胞逃避凋亡，下調(diào)形成纖維化的基因，并獲得一個(gè)類似的表型，但不同于靜止態(tài)的HSC，在促纖維化刺激中能更迅速地重新活化成肌纖維母細(xì)胞，并且強(qiáng)有力地促進(jìn)肝纖維化的形成［21］?；罨腍SC內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平是靜止態(tài)HSC的5～7倍，當(dāng)β-catenin的作用受到阻斷時(shí)HSC的活性也被抑制，而乙醛刺激大鼠的HSC使β-catenin表達(dá)明顯增加。Sept4蛋白只在靜止態(tài)的HSC內(nèi)表達(dá)，HSC通過損失Sept4蛋白后促纖維化轉(zhuǎn)化，在某種程度上由于DKK2和同系物的表達(dá)減少，解除了經(jīng)典Wnt通路的抑制，而DKK2的單苷酸多態(tài)性（SNP）與乙醇損害相關(guān)［22-23］。在 體 外 培 養(yǎng) 的 HSC 中，TGF-β1 通 過（ERK1／2）／GSK-3軸促進(jìn)β-catenin的表達(dá)并增加β-catenin的蛋白穩(wěn)定性，經(jīng)由β-catenin通路下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）的表達(dá)活性而達(dá)到增加α1膠原蛋白的水平［24］。在大鼠的酒精性肝病模型中，研究發(fā)現(xiàn)增加肝細(xì)胞的增殖，視黃醇及視黃酸存儲(chǔ)耗竭，β-catenin和磷酸化的GSK-3β胞質(zhì)和核表達(dá)增加，Wnt7a mRNA和幾種β-catenin的目標(biāo)蛋白包括谷氨酰胺合成酶、細(xì)胞周期蛋白D1、Wnt1誘導(dǎo)的信號(hào)通路蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶7的表達(dá)顯著上調(diào)。以上研究表明在乙醇引起的慢性肝臟疾病中，Wnt／β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可被激活［25］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，乙醛引起的α2Ⅰ型膠原蛋白mRNA和Wnt蛋白的表達(dá)水平是獨(dú)立的，因?yàn)镈KK1沒有阻止這些誘導(dǎo)。β-catenin的小抑制RNA顯著下調(diào)新鮮分離的HSC中致纖維化基因的表達(dá)，在核氧化還原蛋白過度表達(dá)的HSC中β-catenin的核移位受抑制，乙醛增加磷酸化的GSK-3β蛋白并刺激β-catenin的核移位，還增加了細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。穩(wěn)定的β-catenin移位至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)致纖維發(fā)生的通路基因［26］。因此，需深入了解 Wnt／β-catenin信號(hào)通路的作用機(jī)制，為有效逆轉(zhuǎn)ALF提供治療靶點(diǎn)。

3 NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

核轉(zhuǎn) 錄 因 子-κB（NF-κB）家 族 由 NF-κB1、NF-κB2、cRel、Rel-A和 Rel-B組成。這些蛋白質(zhì)任意兩者之間可以形成同源或異源二聚體，二聚化后形成有活性的NF-κB，但其中Rel-B只能與NF-κB1或者NF-κB2有效結(jié)合。它們都有一個(gè)Rel同源結(jié)構(gòu)域，是由300個(gè)氨基酸組成的氨基末端。IκB是NF-κB的強(qiáng)抑制蛋白，有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ、IκBε五個(gè)抑制分子。它們都有兩個(gè)N末端絲氨酸殘基、多個(gè)與降解有關(guān)的C端脯-谷-絲-蘇序列和錨蛋白重復(fù)序列，Rel同源區(qū)調(diào)控錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB的相互作用。在未受刺激的細(xì)胞中NF-κB二聚體通過與細(xì)胞質(zhì)中IκBα、IκBβ、IκBε三個(gè)抑制因子其中之一結(jié)合而呈現(xiàn)無活性狀態(tài)。各種信號(hào)通過使IκB蛋白磷酸化、泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體降解的方式來活化NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合來誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB在炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和腫瘤等重要生理病理過程中發(fā)揮著重要作用。NF-κB能夠被脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、內(nèi)毒素等激活，調(diào)節(jié)包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）等多種基因的表達(dá)，從而呈現(xiàn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生分化，參與肝纖維化的形成。

許多細(xì)胞因子在基因水平上都受到NF-κB的調(diào)控，在腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素（IL）等細(xì)胞因子的啟動(dòng)子上都有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。在病毒性肝炎、酒精性肝病、肝纖維化、肝臟腫瘤等多種肝臟損傷及疾病中都伴有NF-κB活性的改變。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、免疫刺激劑、細(xì)菌病毒、乙醇、氧自由基和細(xì)胞因子等刺激時(shí)，被激活的NF-κB和磷酸化的IκB-α含量增高，通過影響炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)和分泌啟動(dòng)免疫炎性反應(yīng)等多種損傷基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)翻譯過程，參與肝損傷的發(fā)生發(fā)展。NF-κB2可以促進(jìn)ECM增多并積聚，導(dǎo)致HSC活化，實(shí)驗(yàn)證明NF-κB活化和CTGF與ALF的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系。孫屹峰等［27］用參芪扶正注射液治療乙醇灌胃誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低肝纖維化大鼠NF-κB及CTGF mRNA的表達(dá)，降低肝纖維化的進(jìn)展程度。提示抑制NF-κB的活化，下調(diào)CTGF的表達(dá)可以防治并逆轉(zhuǎn)肝纖維化。紫鉚通過NF-κB、JNK、p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路介導(dǎo)乙醇誘導(dǎo)的HSC的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，可抑制由乙醇或乙醛誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和HSC的遷移，從而減少乙醇的毒性，下調(diào)TGF-β、TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)，降低 MMP-2的活性，增加MMP-13的活性，抑制p38 MAPK和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，并顯著抑制NF-κB的抑制劑IκB和Smad3的磷酸化［28］。小鼠酒精性肝細(xì)胞損傷過程中，NF-κB通路被激活，且NF-κB、炎性因子、趨化因子等多種因子表達(dá)增高，NF-κB的激活促進(jìn)HSC的增殖，減少HSC的凋亡，并且可以促進(jìn)膠原蛋白的生成，引起肝組織發(fā)生炎性反應(yīng)、纖維化、壞死和凋亡［29］。而乙醛處理HSC后胞質(zhì)中IκB的含量顯著下降，乙醛可以使IκB降解，使其對(duì)NF-κB的抑制降低，促進(jìn) NF-κB的核轉(zhuǎn)移。但究竟是 HSC的活化影響了NF-κB，還是NF-κB的激活介導(dǎo)了HSC的活化，迄今為止還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

4 小結(jié)

綜上所述，HSC活化、增殖和凋亡所涉及的調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)繁多，TGF-β／Smads通路、Wnt／β-catenin通路和NF-κB通路彼此之間聯(lián)系錯(cuò)綜復(fù)雜，共同介導(dǎo)著ALF的發(fā)生發(fā)展，了解掌握彼此的關(guān)聯(lián)對(duì)逆轉(zhuǎn)纖維化有著至關(guān)重要的作用。以酒精性肝病傳統(tǒng)治療為基礎(chǔ)，通過干預(yù)各信號(hào)介導(dǎo)途徑，建立干預(yù)HSC激活凋亡的分子治療靶點(diǎn)可以有效達(dá)到治療目的。然而，各個(gè)通路的作用機(jī)制及其相互聯(lián)系目前尚不明確，需要更深入的研究剖析在HSC中的多條信號(hào)通路發(fā)揮的作用和聯(lián)系，才能有望徹底逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

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