香榧假種皮醇提物抑制植物病原菌活性及乳油制備初步研究

劉冰冰+李穎+樊佳祺+王國(guó)夫+孫小紅

摘要：以乙醇作為提取劑制備香榧（Torreya grandis Merrilli）假種皮醇提物，并研究醇提物乳油制劑制備工藝。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定醇提物及其乳油對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）5種植物源病原菌的抑菌效果。結(jié)果表明，香榧假種皮醇提物對(duì)番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌等5種植物源病原菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，10 mg/mL時(shí)對(duì)5種病菌的抑制率都在40%以上;篩選出乳油的最佳配方為香榧假種皮醇提物14%、乳化劑（吐溫-20）15%、溶劑（乙酸乙酯）71%，乳油對(duì)5種病菌的抑制率都在50%以上?？梢?jiàn)香榧假種皮醇提物抑菌譜較廣，值得進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。

關(guān)鍵詞：香榧（Torreya grandis Merrilli）假種皮;乙醇提取物;乳油制劑;抑菌活性;植物病原菌

中圖分類號(hào)：S482.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0349-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.023

Antifungal Activities of Ethanol Extracts from Torreya grandis Merrilli Aril and ?Preparation of Emulsifiable Concentrates

LIU Bin-bin，LI Ying，F(xiàn)AN Jia-qi，WANG Guo-fu，SUN Xiao-hong

（Yuanpei College，Shaoxing University，Shaoxing 312000，Zhejiang，China）

Abstract： The antifungal activities of ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril and its emulsifiable concentrates to Alternaria solani， Pyricularia oryzae， Bipolaris maydis，Pseudoperonospora cubensis，F(xiàn)usarium oxysporum f. sp. cucumerinum were tested in vitro. The preparation of emulsifiable solution was studied. The results showed that ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril had strong inhibitory effects on five phytopathogens， with the inhibiting rate of more than 40% at the concentration of 10 mg/mL. The optimal emulsifiable concentrates were ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril 14%， solvent（ethyl acetate） 71%， emulsifying agent （Tween-20）15%. The inhibitive rates of emulsifiable concentrates to five fungi were more than 50%. The ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril had antifungal activities and were needed to be studied further.

Key words： Torreya grandis Merrilli aril; alcohol extract; emulsifiable concentrates; antifungal activity; phytopathogens

香榧（Torreya grandis Merrilli）為紅豆杉科（紫杉科，Taxaceae）榧屬（Torreya）常綠喬木，系裸子植物，是第三紀(jì)孑遺植物，又稱細(xì)榧、木皮子、羊角榧等，為稀有堅(jiān)果類樹(shù)種，其果實(shí)香榧果具有食用和藥用價(jià)值[1，2]。香榧果實(shí)一直備受青睞和肯定，但約占其種子鮮重50%～60%的假種皮部分則沒(méi)有得到有效利用，長(zhǎng)期被當(dāng)作加工廢棄物，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境。

香榧假種皮富含多種活性物質(zhì)，如黃酮類、二萜類、木脂素類化合物，還有醇、醛、烯、酚等植物芳香物質(zhì)，某些物質(zhì)還具有很強(qiáng)的抑菌活性，如木脂素類化合物、烯類化合物等。胡劉巖等[3]研究發(fā)現(xiàn)香榧?xì)]發(fā)油含有大量的檸檬烯、蒎烯等具有抑菌作用的活性成分，這可能是其具有抑菌生物活性的原因。然而關(guān)于香榧假種皮提取物抑菌活性的研究報(bào)道較為鮮見(jiàn)。

植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，而目前防治植物病害的主要手段為施用化學(xué)殺菌劑。由于化學(xué)農(nóng)藥有潛在危害，研制開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用安全、高效的生物農(nóng)藥已成為現(xiàn)代農(nóng)藥的主流。從植物中尋找抗菌活性物質(zhì)是目前開(kāi)發(fā)無(wú)公害農(nóng)藥的重要途徑之一。本研究在測(cè)定香榧假種皮乙醇提取物抗菌活性的基礎(chǔ)上，嘗試將其制備成環(huán)保型乳油，旨在為創(chuàng)制和發(fā)展新型植物源農(nóng)藥提供參考。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?植物樣品 ?香榧假種皮收集自浙江省紹興市稽東鎮(zhèn)香榧基地，經(jīng)紹興文理學(xué)院元培學(xué)院金自學(xué)教授鑒定為Torreya grandis Merrilli 的假種皮，置于陰涼通風(fēng)處自然陰干。

1.1.2 ?供試菌種 ?黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 ?測(cè)定方法

1.2.1 ?醇提物制備 ?將香榧假種皮用中藥粉碎機(jī)粉碎，取200 g粉碎物于2 000 mL圓底燒瓶加70%乙醇1 000 mL回流提取2 h，過(guò)濾，取濾液旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏，制成香榧假種皮醇提物，密封后于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?醇提物抑菌活性測(cè)定 ?采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定[4，5]。將香榧醇提物浸膏用少量二甲基亞砜溶解，用無(wú)菌水定容，配制成各濃度供試藥液。在無(wú)菌條件下，將供試菌種用7 mm的打孔器打出一定數(shù)量的菌餅備用。熔化PDA培養(yǎng)基，用移液槍移取0.5 mL藥液放入培養(yǎng)皿內(nèi)，趁熱倒入14.5 mL培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中制成厚薄均勻的平板，使培養(yǎng)基的藥液最終濃度為2、4、6、8、10 mg/mL，以添加含有同樣濃度的二甲基亞砜的無(wú)菌水為對(duì)照。每培養(yǎng)皿放置1個(gè)菌餅，菌絲面向下，重復(fù)3次，（28±1） ℃培養(yǎng)，72 h后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，評(píng)判醇提物抑菌活性。

菌落直徑=菌落測(cè)量直徑-菌餅直徑;菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.3 ?醇提物乳油配方確定

1）溶劑篩選。為保證劑型環(huán)保，在乳油溶劑篩選中，棄用三苯類、芳烴類及氯仿等有毒溶劑，選擇毒性相對(duì)較低的有機(jī)溶劑。取約10 mg的香榧假種皮醇提物浸膏，點(diǎn)于凹形載玻片的凹面內(nèi)，再用移液槍吸取50 μL的溶劑點(diǎn)于浸膏的一側(cè)，加蓋玻片，觀察擴(kuò)散速度;室溫靜置1 h后，觀察溶解情況。若沒(méi)有完全溶解，再滴加10 μL溶劑，再觀察，可逐次滴加溶劑，直至完全溶解。用20倍體視顯微鏡加以確認(rèn)。為防止溶劑揮發(fā)，可用凡士林密封蓋玻片。所用溶劑有丙酮、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、甲醇等。根據(jù)浸膏在溶劑中的擴(kuò)散速度和溶解度，初步篩選出較佳溶劑。試驗(yàn)過(guò)程中，注意避免空氣流動(dòng)。

2）乳化劑篩選。棄用農(nóng)乳系列，選擇毒性相對(duì)較低的乳化劑。以醇提物浸膏280 mg，以溶劑篩選確定的溶劑2 mL為基礎(chǔ)，進(jìn)行乳化劑篩選。觀察所配制劑的外觀，以能形成均相透明、乳化性能好的乳化劑入選。

3）乳油穩(wěn)定性檢測(cè)。在250 mL燒杯中，加入10 mL （30±2） ℃標(biāo)準(zhǔn)硬水（氯化鈣0.304 g、六水氯化鎂0.139 g，以蒸餾水定容至1 000 mL）。用移液管吸取適量乳油試樣，在不斷攪拌的情況下慢慢加入硬水中，配成100 mL乳狀液。2～3 r/s攪拌30 s，將乳狀液移到清潔、干燥的100 mL量筒中，（30±2） ℃恒溫靜置水浴1 h，觀察乳狀液分離情況。量筒中無(wú)浮油（膏）、沉油和沉淀析出，則判定乳油穩(wěn)定性合格[4]。

4）乳油分散性檢測(cè)。將裝有500 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水的大燒杯置于25 ℃的恒溫水浴中，溫度平衡后用移液管吸取l mL乳油，離液面1 cm滴下，觀察分散性。如能迅速地自動(dòng)分散，水體變?yōu)槿榘咨该鳡?，則認(rèn)為其擴(kuò)散完全，判定乳油分散性合格。

1.2.4 ?乳油抑菌活性測(cè)定 ?按最佳配方配制香榧假種皮醇提物乳油，測(cè)定其對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用[6]，測(cè)定方法同“1.2.2”。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ? 醇提物對(duì)植物病原菌的抑制作用

不同濃度的香榧假種皮醇提物對(duì)5種供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用（表1），說(shuō)明其抗菌譜較廣。其中對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最佳，抑制率均在62%以上，在醇提物濃度為10 mg/mL時(shí)抑制率最大，為79.57%。對(duì)水稻稻瘟病菌和黃瓜霜霉病菌菌絲生長(zhǎng)最大抑制效果相近，其中，對(duì)水稻稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果隨醇提物濃度增加而明顯增加，在最大濃度10 mg/mL時(shí)，抑制效果最佳，抑制率為68.97%;對(duì)黃瓜霜霉病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果隨醇提物濃度增加變化不明顯。對(duì)玉米小斑病菌，在10 mg/mL和6 mg/mL時(shí)的抑制率分別為56.08%和53.83%，2 mg/mL時(shí)抑制率在50%以下;對(duì)于番茄早疫病菌，抑制率均在50%以下，抑菌效果較差。

2.2 ?醇提物乳油配方篩選結(jié)果

香榧假種皮醇提物在各溶劑中擴(kuò)散速度從快到慢依次為乙酸乙酯、丙酮、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇，溶解度分別為0.14 mg/μL（乙酸乙酯）、0.11 mg/μL（丙酮）、0.07 mg/μL（無(wú)水乙醇），0.06 mg/μL（無(wú)水甲醇），篩選得到的最佳溶劑為乙酸乙酯。以乙酸乙酯為溶劑進(jìn)行乳化劑篩選（表2），最終篩選出的最佳乳油配方為醇提物14%、乳化劑（吐溫-20）15%，溶劑（乙酸乙酯）71%。

2.3 ?醇提物乳油對(duì)植物病原菌的抑制作用

香榧假種皮醇提物乳油對(duì)5種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定結(jié)果（表3）表明，10 mg/mL香榧假種皮醇提物乳油對(duì)5種供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用。其中對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最佳，抑制率為85.70%;對(duì)黃瓜霜霉病菌、番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、水稻稻瘟病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為71.92%、50.46%、59.02%、74.49%，其抑菌效果優(yōu)于醇提物。endprint

3 ? 小結(jié)與討論

長(zhǎng)期以來(lái)，香榧假種皮作為廢物丟棄，既浪費(fèi)了資源，又造成了環(huán)境的污染。已有研究表明，香榧假種皮富含多種活性成分，具有抑菌以及殺蟲(chóng)生物活性[7，8]。對(duì)香榧假種皮采用70%乙醇回流提取活性成分，得到乙醇浸膏，制成不同濃度的溶液，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，不同濃度的醇提物對(duì)各供試菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性普遍較高，其中對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最佳，各濃度抑制率均在62%以上。可見(jiàn)，香榧假種皮醇提物抑菌譜較廣，且活性較強(qiáng)，具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。同時(shí)也證實(shí)香榧假種皮含有抑菌活性化合物，具體成分和作用機(jī)理有待深入研究。

乳油是農(nóng)藥傳統(tǒng)基本劑型之一，與其他農(nóng)藥劑型相比，乳油有效成分含量較高、貯存穩(wěn)定性好、工藝簡(jiǎn)單，至今依然是國(guó)內(nèi)和發(fā)展中國(guó)家主要使用的農(nóng)藥劑型。但由于有機(jī)溶劑用量大，容易污染環(huán)境，使用率有所下降。選擇使用環(huán)境友好、生物降解性好、低刺激、高效率的綠色表面活性劑應(yīng)用于乳油生產(chǎn)，有助于降低助劑對(duì)環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品安全的潛在威脅[9]。本研究對(duì)香榧假種皮醇提物浸膏分別通過(guò)溶劑和乳化劑的篩選、乳油穩(wěn)定性和分散性的測(cè)定，確定最佳配方，制備乳油對(duì)其抑菌活性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，香榧假種皮醇提物乳油在一定濃度（10 mg/mL）下，對(duì)5種供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用， 且菌絲生長(zhǎng)抑制率均高于醇提物?？梢?jiàn)， 相同提取物含量的乳油抑菌效果更好。這與田秀玲[10]報(bào)道的蛇床子乳油比提取液藥效高的結(jié)論相符。在開(kāi)發(fā)新型植物源殺菌劑方面，香榧假種皮醇提物具有較大的潛力， 可對(duì)其進(jìn)行深入研究。

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