椎間盤(pán)退變性疾病相關(guān)基因的研究進(jìn)展

陳思進(jìn) 廖歆 王倚天 楊欣建

椎間盤(pán)退變性疾病是骨科常見(jiàn)的疾病之一，也是引起腰痛的主要原因［1］，臨床上約20%的下腰痛由椎間盤(pán)退變引起［2］。退變的椎間盤(pán)細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列有害的生化改變，致使細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)載荷發(fā)生變化，進(jìn)而誘發(fā)疼痛［3］。目前，上述椎間盤(pán)細(xì)胞內(nèi)外生化改變的機(jī)制仍不明確，主要有基因遺傳學(xué)說(shuō)［4］、細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)［5］等。近年來(lái)，椎間盤(pán)退變性疾病的實(shí)驗(yàn)對(duì)象和研究方法的發(fā)展，促進(jìn)了對(duì)椎間盤(pán)退變性疾病相關(guān)基因的研究，現(xiàn)作如下綜述。

一、椎間盤(pán)退變研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象

病變椎間盤(pán)是大多數(shù)學(xué)者首選的實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本［6］，但由于倫理問(wèn)題，難以收集對(duì)照組的正常椎間盤(pán)。胡明等［7］的研究中采用經(jīng)倫理委員會(huì)同意的自然流產(chǎn)胎兒的椎間盤(pán)作為對(duì)照組。Zhao等［8］的研究中選擇有嚴(yán)重臨床表現(xiàn)、MRI證實(shí)為椎間盤(pán)退變、Pfirrmann分級(jí)為Ⅳ～Ⅴ級(jí)、切除術(shù)后HE 染色證實(shí)為退變、排除腫瘤和感染的標(biāo)本納入實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組樣本則來(lái)自于腰椎爆裂骨折需融合取出椎間盤(pán)，既往影像學(xué)未見(jiàn)明顯退變的患者。亦有學(xué)者采用動(dòng)物模型進(jìn)行研究。然而，自然流產(chǎn)的胎兒缺乏相應(yīng)影像學(xué)分級(jí)支持，較難鑒別椎間盤(pán)是否已退變；應(yīng)用動(dòng)物模型雖擺脫了相關(guān)倫理問(wèn)題，但是否真正能夠反映人椎間盤(pán)的情況，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，多數(shù)學(xué)者采納經(jīng)影像學(xué)證實(shí)并分級(jí)的退變椎間盤(pán)及爆裂骨折后需融合取出的椎間盤(pán)。

二、椎間盤(pán)退變的研究方法

蔡利軍等［9］采用免疫組化方法，標(biāo)本冰凍后切片，聚丁二酸丁二醇酯（poly butylene succinate，PBS）沖洗，N，N－二丁基丙烯酰胺（N，N－dibutylacryla－mide，DBA）溶液對(duì)目標(biāo)基因下游產(chǎn)物進(jìn)行染色，以顏色深淺為標(biāo)準(zhǔn)，觀察目標(biāo)基因下游產(chǎn)物在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)情況。部分學(xué)者應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法，提取間盤(pán)組織RNA，行PCR 擴(kuò)增，后在瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析［10］。近年來(lái)，DNA 微陣列分析成為多數(shù)學(xué)者熱門(mén)的研究方法，將標(biāo)本按類(lèi)別分類(lèi)，與基因芯片相結(jié)合，快速檢測(cè)標(biāo)本的基因表達(dá)，再與GEO 數(shù)據(jù)中心的數(shù)據(jù)相比較，來(lái)顯示過(guò)表達(dá)及未表達(dá)的基因，同時(shí)研究表達(dá)的基因蛋白相互之間可能存在的聯(lián)系［11］。Zhang等［12］在DNA 微陣列的基礎(chǔ)上，采取TSP（top－score pair）的方法，通過(guò)應(yīng)用計(jì)算公式計(jì)算分?jǐn)?shù)，來(lái)研究環(huán)境因素對(duì)基因成對(duì)表達(dá)的影響，并認(rèn)為分?jǐn)?shù)越高，成對(duì)表達(dá)的基因內(nèi)在聯(lián)系越緊密。免疫組化法雖簡(jiǎn)便易行，但此法研究目標(biāo)基因較少，無(wú)法準(zhǔn)確研究多基因內(nèi)在間的聯(lián)系；DNA 微陣列雖可快速檢測(cè)過(guò)度表達(dá)基因，但成本過(guò)高成為此法不能普及的一個(gè)限制因素。

三、椎間盤(pán)退變的相關(guān)基因及可能機(jī)制

椎間盤(pán)由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板這幾個(gè)重要部分組成。其可能的營(yíng)養(yǎng)途徑主要有兩種：①軟骨終板下血管袢將絕大部分氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送至軟骨終板、椎間盤(pán)基質(zhì)，最終到達(dá)內(nèi)部的椎間盤(pán)細(xì)胞，此即終板途徑；②少部分營(yíng)養(yǎng)來(lái)源于纖維環(huán)外圍的血管網(wǎng)，向內(nèi)層滲透，傳遞營(yíng)養(yǎng)，即纖維環(huán)途徑［13，14］。任何一個(gè)環(huán)節(jié)中的相關(guān)基因表達(dá)出現(xiàn)問(wèn)題都可能導(dǎo)致椎間盤(pán)發(fā)生退變。

（一）生長(zhǎng)合成相關(guān)基因

椎間盤(pán)生長(zhǎng)合成相關(guān)基因主要包括LIM 礦化蛋白－1（LIM mineralization protein－1，LMP－1）、Y染色體性別決定結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子9（Sox9）基因、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）、類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin－like growth factor，IGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的基因。

1．LIM 礦化蛋白－1（LMP－1）基因 LMP－1是一種主要在骨骼中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)非分泌性骨誘導(dǎo)蛋白，能促進(jìn)成骨細(xì)胞骨鈣素的分泌及骨結(jié)節(jié)的形成，主要在骨的鈣化階段發(fā)揮作用，并在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起正調(diào)節(jié)作用［15］。LMP－1通過(guò)增加椎間盤(pán)細(xì)胞的透明樣基質(zhì)來(lái)維持椎間盤(pán)軟骨。通過(guò)BMP介導(dǎo)LMP－1含量的上調(diào)，能夠提高椎間盤(pán)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白及蛋白多糖的含量，從而減緩椎間盤(pán)的退變。同時(shí)，LMP－1能上調(diào)BMP－2和BMP－7的表達(dá)，并增強(qiáng)其協(xié)同成骨作用。

2．Y 染色體性別決定結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子9（Sox9）基因 Sox9是合成Ⅱ型膠原蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，能促使Ⅱ型膠原及軟骨的發(fā)育，而Ⅱ型膠原是椎間盤(pán)基質(zhì)內(nèi)保持椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)、功能的重要物質(zhì)。Sowa等［16］研究發(fā)現(xiàn)，Sox9在椎間盤(pán)退變患者內(nèi)的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，且Ⅱ型膠原蛋白的含量亦低于對(duì)照組。

3．轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（TGF－β）基因 TGF－β是一類(lèi)具有生長(zhǎng)潛能的因子，可促進(jìn)椎間盤(pán)的蛋白多糖合成以及Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，從而穩(wěn)定椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)。最新研究表明TGF－β超家族能夠雙向調(diào)節(jié)椎間盤(pán)，早期促進(jìn)椎間盤(pán)的蛋白多糖合成以及Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，晚期TGF－β1產(chǎn)生大量Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原，加重椎間盤(pán)的纖維化［17］。因此，早期TGF－β為椎間盤(pán)修復(fù)性基因，其中TGF－β1的作用最大，晚期則成為椎間盤(pán)退變的可能原因之一。

4．類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）基因 IGF 亦稱(chēng)為生長(zhǎng)激素介質(zhì)，是生長(zhǎng)激素產(chǎn)生生理作用過(guò)程中必需的一種活性蛋白多肽，包括IGF－1和IGF－2。其中IGF－1在椎間盤(pán)的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。Urano等［18］研究表明，IGF－1的位點(diǎn)突變與脊柱退行性病變相關(guān)。該基因可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)軟骨發(fā)育，對(duì)軟骨的穩(wěn)定與營(yíng)養(yǎng)都起著重要作用。

5．骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）基因 BMP 是促使多組織發(fā)生重構(gòu)的超家族生長(zhǎng)因子，與椎間盤(pán)相關(guān)的有BMP－2、BMP－7等。有研究顯示BMP－2 可正向調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促使椎間盤(pán)蛋白多糖及膠原的表達(dá)。BMP－7 可促使椎間盤(pán)中的髓核細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，產(chǎn)生Ⅱ型膠原與黏多糖。Wei等［19］研究顯示，在細(xì)胞凋亡的外環(huán)境中上調(diào)BMP－7，可使椎間盤(pán)內(nèi)膠原及蛋白多糖含量相對(duì)穩(wěn)定。

（二）椎間盤(pán)分解代謝相關(guān)基因

椎間盤(pán)分解代謝相關(guān)基因主要包括：程序化死亡5（programmed cell death 5，PDCD5）基因、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族、金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）家族、含血小板結(jié)合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）家族等。

1．程序化死亡5（PDCD5）基因 PDCD5是一個(gè)表達(dá)廣泛的促凋亡分子，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的凋亡。蔡利軍等［9］研究發(fā)現(xiàn)PDCD5在病變組中表達(dá)明顯高于對(duì)照組。有研究表明PDCD5明顯上調(diào)能夠?qū)е鹿切躁P(guān)節(jié)炎軟骨的凋亡退變，軟骨基質(zhì)丟失伴隨軟骨下骨增生，參與骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程。與此同時(shí)，PDCD5協(xié)同F(xiàn)AS基因，參與細(xì)胞凋亡，也是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的可能機(jī)制之一［20］。

2．基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族 MMP超家族有多種亞型，其中最重要的為1～3亞型，主要作用為降解間盤(pán)內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖。而膠原的喪失是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的直接原因之一。MMP1 基因能夠影響SNP 位點(diǎn)第1607鳥(niǎo)苷酸的序列，繼而改變啟動(dòng)子活性，影響轉(zhuǎn)錄水平。與此同時(shí)，MMP1亦能降解蛋白黏多糖，使得椎間盤(pán)穩(wěn)定性下降，引發(fā)退變。

3．金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）家族 TIMP 家族有3種亞型，其中椎間盤(pán)中可見(jiàn)前2種亞型表達(dá)。TIMP可與MMP等比結(jié)合形成非共價(jià)鍵，進(jìn)而抑制MMP對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用。肖斌等［21］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TIMP 等位基因TT 類(lèi)型的人群患腰椎間盤(pán)退變的概率明顯升高，TIMP－1的基因多態(tài)性與腰椎間盤(pán)退變發(fā)生明顯相關(guān)。

4．含血小板結(jié)合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）家族 ADAMTS家族是一類(lèi)具有降解蛋白多糖能力的超家族蛋白酶，在正常組織中含量較少，主要參與機(jī)體的發(fā)育、老化、炎癥等，其中ADAMTS－4、ADAMTS－5在椎間盤(pán)退變中起到重要的作用。ADAMTS－4可直接作用于親水性氨基葡萄糖聚糖蛋白多糖，使其降解，而親水性氨基葡萄糖聚糖蛋白多糖的降解被認(rèn)為是椎間盤(pán)早期退變的標(biāo)志。ADAMTS－5 功能與作用機(jī)制類(lèi)似于ADAMTS－4，但與其他亞型不同的是具有C 段的凝血酶敏感蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)，這一特殊結(jié)構(gòu)能夠使其定位于某些特殊組織的特定位置。

（三）骨質(zhì)疏松相關(guān)基因

骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的代表為維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）基因。維生素D 是一種類(lèi)固醇激素，與骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。VDR有4個(gè)基因的位點(diǎn)，其多態(tài)性的基因位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ的酶切位點(diǎn)［22］。Videman等［23］發(fā)現(xiàn)，在椎間盤(pán)組織中，后兩個(gè)酶切位點(diǎn)（即FokⅠ、TaqⅠ）等維生素D 受體基因的表達(dá)與椎間盤(pán)退變相關(guān)，體現(xiàn)為椎間盤(pán)在磁共振T2加權(quán)像成低信號(hào)。

（四）結(jié)構(gòu)相關(guān)基因

1．膠原基因 椎間盤(pán)纖維環(huán)膠原蛋白能夠維持椎間盤(pán)的穩(wěn)定性及韌性，膠原原因（collagen gene）主要包括Ⅰ型膠原（COL1A1）基 因、Ⅱ型膠原（COL2）基因、Ⅸ型膠原（COL9A1、COL9A2、COL9A3）基因以及Ⅺ型膠原（COL11A1、COL11A2）基因。

（1）Ⅰ型膠原（COL1A1）基因 Ⅰ型膠原廣泛存在于椎間盤(pán)纖維環(huán)組織，在退變的髓核中也可發(fā)現(xiàn)。Kellgren－Lawrence評(píng)分法顯示COL1A1基因TT 表型者椎間盤(pán)退變的發(fā)病率最高，屬高?；?。

（2）Ⅱ型膠原（COL2）基因 Ⅱ型膠原占椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的近一半含量，是椎間盤(pán)穩(wěn)定的關(guān)鍵性膠原，其含量的減少直接導(dǎo)致Ⅰ、Ⅱ型膠原比例的失調(diào)，造成椎間盤(pán)穩(wěn)定性下降。

（3）Ⅸ型膠原（COL9A1、COL9A2、COL9A3）基因 三者共同編碼Ⅸ型膠原，參與纖維環(huán)間膠原的橋接。其中COL9A2在椎間盤(pán)退變中起著重要的角色。Trp2等位基因（色氨酸的密碼子）取代COL9A2基因上編碼精氨酸的密碼子后，Ⅸ型膠原蛋白的多肽鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其相應(yīng)的連接作用下降，導(dǎo)致椎間盤(pán)的承重及彈性下降，從而引發(fā)椎間盤(pán)退變。

（4）Ⅺ膠原基因（COL11A1、COL11A2） Ⅺ膠原含量較少，部分存在于髓核與纖維環(huán)中，且隨著年齡的增加含量遞減。Ⅺ膠原基因發(fā)生異常會(huì)增加椎間盤(pán)膨出的危險(xiǎn)度［24］。

2．聚集蛋白多糖 聚集蛋白多糖（aggrecan，AGC）廣泛存在于椎間盤(pán)基質(zhì)中，對(duì)間盤(pán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有著重要作用［25］。有研究顯示AGC 基因存在可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)片段的多態(tài)性，其多態(tài)性與椎間盤(pán)退變的嚴(yán)重程度以及多節(jié)段椎問(wèn)盤(pán)退變相關(guān)［26］。

（五）炎癥因子類(lèi)基因

在椎間盤(pán)退變的過(guò)程中，始終存在著慢性炎癥，各種炎癥因子中以白細(xì)胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）及腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－alpha，TNF－α）最為熱門(mén)。胡寶山等［27］研究顯示IL－1β可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，從而降解蛋白多糖，同時(shí)IL－1β可直接降低人體痛閾，繼而產(chǎn)生癥狀。TNF－α主要由單核－巨噬細(xì)胞分泌，其主要作用為抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞溶解。在退變的椎間盤(pán)中，TNF－α可促使炎癥細(xì)胞釋放溶解酶，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，同時(shí)促使成纖維細(xì)胞增殖，形成瘢痕。

四、存在的問(wèn)題

椎間盤(pán)退變性疾病基因方面研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)椎間盤(pán)退變性疾病的易感因素、可能機(jī)制、有效的早期生物學(xué)預(yù)防或治療方面作了多方面的研究，有一部分研究也通過(guò)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用于臨床。然而仍有許多問(wèn)題有待解決，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

（一）椎間盤(pán)退變機(jī)制尚未明確

雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在椎間盤(pán)方面作了許多研究，但仍沒(méi)有一個(gè)達(dá)成共識(shí)的椎間盤(pán)退變機(jī)制。對(duì)椎間盤(pán)退變機(jī)制的探索始終是一個(gè)復(fù)雜而艱辛的過(guò)程，對(duì)其形成、營(yíng)養(yǎng)、代謝的相關(guān)基因、細(xì)胞因子、環(huán)境都只有一個(gè)粗略的研究。各基因間的相互聯(lián)系，椎間盤(pán)內(nèi)滲透壓環(huán)境的改變對(duì)細(xì)胞、結(jié)構(gòu)有無(wú)影響以及各蛋白之間相互作用的途徑都是未來(lái)研究的熱點(diǎn)［3，28］。

（二）正常椎間盤(pán)標(biāo)本無(wú)法有效獲取

因倫理問(wèn)題，正常的椎間盤(pán)標(biāo)本往往無(wú)法有效獲取。因此，正常對(duì)照組的缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性、有效性提出了挑戰(zhàn)。代替對(duì)照組標(biāo)本的多為爆裂骨折后患者術(shù)前影像學(xué)椎間盤(pán)信號(hào)未改變的椎間盤(pán)，然而急性應(yīng)激狀態(tài)，這些“正?！弊甸g盤(pán)的環(huán)境、蛋白、細(xì)胞炎癥因子并不能確認(rèn)是否發(fā)生了亞急性的改變或是否與正常椎間盤(pán)相類(lèi)似。且良好的動(dòng)物模型始終未能很好的建立，動(dòng)物模型的椎間盤(pán)與正常人類(lèi)椎間盤(pán)有著不小的差異，不具備很好的代表性。因此，良好的對(duì)照標(biāo)本、適宜的模型都是未來(lái)值得深思和探索的方向。

（三）基因等生物治療轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面的困難

對(duì)于椎間盤(pán)退變性疾病的基因?qū)W治療也是近年來(lái)的熱點(diǎn)課題?；蛑委熓峭ㄟ^(guò)將靶向基因通過(guò)直接注入或間接分離培養(yǎng)修飾后重新植入靶向器官來(lái)達(dá)到預(yù)防、治療相關(guān)疾病。利用基因治療方法，有利于早期從源頭預(yù)防及控制疾病的發(fā)生，避免了嚴(yán)重的后果及并發(fā)癥。目前有研究顯示LMP－1基因重組蛋白在體內(nèi)無(wú)明顯活性，在應(yīng)用LMP－1基因治療時(shí)，需向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染LMP－1 基因，從而刺激活性蛋白［29］。但基因治療目前只屬于理論及實(shí)驗(yàn)階段，并未大規(guī)模臨床應(yīng)用，對(duì)于基因生物治療其療效如何，如何利用病毒載體攜帶目的基因，如何進(jìn)行靶基因的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后如何判斷是否產(chǎn)生具有活性蛋白，及是否會(huì)因基因改變而導(dǎo)致其他意想不到的并發(fā)癥，這些都是目前基因在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面面臨的挑戰(zhàn)，也是今后發(fā)展的領(lǐng)域。

總之，目前椎間盤(pán)退變的基因?qū)W研究尚處在一個(gè)起始階段，基因與環(huán)境共同影響著椎間盤(pán)的退變，如何探索好、利用好基因這一利器，更好的做到個(gè)體化治療，仍是任重而道遠(yuǎn)。

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