Numb蛋白對(duì)α-synuclein蛋白寡泛素化水平的調(diào)控

王 躍， 丁雪冰， 王雪晶，2， 張?chǎng)?荊 婧， 馬耀華， 滕軍放，2

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，其主要病理變化為黒質(zhì)-多巴胺系統(tǒng)受損使多巴胺神經(jīng)元大量減少，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、震顫等錐體外系癥狀出現(xiàn)。α-突出核蛋白(α-synuclein，α-syn)是一種在腦組織中含量豐富的小蛋白質(zhì)，尤其在神經(jīng)元細(xì)胞漿高表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量為18～20 kD，α-syn蛋白發(fā)生部分折疊并相互作用形成寡聚體，α-syn寡聚體聚積產(chǎn)生細(xì)胞毒性導(dǎo)致神經(jīng)元變性與PD的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系［1］。Numb基因是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的決定細(xì)胞不對(duì)稱分裂的基因，通過(guò)Numb/Notch途徑在生物的神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。Numb蛋白與Notch蛋白通過(guò)相互拮抗作用調(diào)控UPS，參與某些蛋白的的泛素化修飾［2］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于Numb蛋白對(duì)α-syn蛋白寡泛素化水平調(diào)控的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)Numb與α-syn的相互作用，旨在深入探求Numb蛋白對(duì)α-syn寡泛素化水平的調(diào)控及誘導(dǎo)α-syn包涵體形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院唐北沙教授饋贈(zèng)，EGFP-N1、EGFP-Numb、HA-α-synuclein 為蘇州大學(xué)王光輝教授饋贈(zèng)。ProteinG購(gòu)于羅氏公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含15%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟參考脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Numb蛋白和α-syn蛋白的亞細(xì)胞共定位 將轉(zhuǎn)染后的SH-SY5Y細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后用1×PBS洗滌2次后加入4%的多聚甲醛，室溫下固定10 min，再用1×PBS洗滌3次，加入0.25%的TritonX-100/PBS透化10 min，經(jīng)1×PBS洗滌后，加入一抗α-FLAO/PBST室溫下孵育2 h，經(jīng)1×PBST洗滌3次后加入二抗 α-mouse-Rho/PBST室溫避光1h，再經(jīng)1×PBST洗滌3次后，加入Hochest于室溫下避光孵育3 min復(fù)染細(xì)胞核，經(jīng)1×PBST洗滌3次后用熒光顯微鏡觀察，并在400倍視野下，在各組細(xì)胞隨機(jī)抽取3個(gè)以上不相重復(fù)的視野觀察拍照。

1.2.3 免疫共沉淀 轉(zhuǎn)染24 h后，加入10 μmol/L MG132處理，24 h后收集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后于冰上放置10 min，4℃下12000r/min離心25 min后收集上清，取40μl上清加入等體積Loading buffer 100℃煮沸10 min，4℃保存。其余上清用于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。取40μl Protein G分別加入30μl 5%BSA、700μl PBS以及4μl相應(yīng)抗體，4℃ 孵育6 h，洗滌沉淀3次，加入上述剩余上清液4℃ 過(guò)夜。次日，冰上震蕩2 h，反復(fù)洗滌8次。去上清加入等體積Loading buffer 100℃煮沸7 min。離心取上清進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。

1.2.4 Western-blot檢測(cè) 取 10 μl上清進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，在1×TBST中洗滌3次，加入相應(yīng)一抗，4℃ 孵育過(guò)夜。次日，用1×TBST洗膜3次后加入相應(yīng)的二抗，室溫下在搖床上孵育2 h，洗膜后加入ECL試劑，暗室內(nèi)X膠片曝光顯影。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) α-syn包涵體 將SH-SY5Y細(xì)胞以4×105/ml接種于六孔板里，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入終濃度為1 mmol/L的MPP+處理36 h，分別將EGFP-N1或EGFP-Numb轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后經(jīng)4%的多聚甲醛固定、0.25%的TritonX-100/PBS透化，經(jīng)1×PBS洗滌后，加入一抗 α-FLAO/PBST室溫下孵育2 h，經(jīng)1×PBST洗滌3次后加入二抗α-mouse-Rho/PBST室溫避光1 h，再經(jīng)1×PBST洗滌3次后，加入Hochest于室溫下避光孵育3 min染細(xì)胞核，經(jīng)1×PBST洗滌3次后用熒光顯微鏡觀察，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)以上視野進(jìn)行觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Numb蛋白與α-syn蛋白的亞細(xì)胞共定位

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，將EGFP-Numb與HA-αsyn共同轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，可見(jiàn)HA-α-syn呈核周分布，EGFP-Numb呈全細(xì)胞分布，核膜周圍較明顯，Numb蛋白與α-syn蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞中存在亞細(xì)胞共定(見(jiàn)圖1)。

2.2 Numb蛋白與α-syn的結(jié)合 分別將EGFP-N1或EGFP-Numb與HA-α-syn共同轉(zhuǎn)染后進(jìn)行免疫共沉淀，經(jīng)Western-blot分析，結(jié)果顯示，與EGFP-N1組對(duì)比，過(guò)表達(dá)EGFP-Numb組的沉降復(fù)合物中可檢測(cè)到α-syn蛋白的存在，表明Numb蛋白與α-syn蛋白相互結(jié)合(見(jiàn)圖2)。

2.3 Numb上調(diào)α-syn寡泛素化水平 分別將EGFP-N1或EGFP-Numb與HA-α-syn共同轉(zhuǎn)染，24 h后加MG132處理。轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞裂解液，用anti-HA抗體進(jìn)行免疫沉淀后、用anti-Ub檢測(cè)αsyn泛素化水平。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與EGFP-N1組相比，EGFP-Numb組的α-syn寡泛素化水平明顯上調(diào)(見(jiàn)圖3)。

2.4 Numb誘導(dǎo)MPP+細(xì)胞模型中α-syn包涵體的形成 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在MPP+細(xì)胞模型中，與 EGFP-N1組相比，EGFP-Numb組中 αsyn包涵體增多。這表明Numb促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的α-syn包涵體形成(見(jiàn)圖4)。

圖1 SH-SY5Y細(xì)胞中Numb與α-synuclein的亞細(xì)胞共定位1-A中紅色標(biāo)記α-syn表達(dá);1-B綠色標(biāo)記Numb表達(dá);1-C藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核;1-D中箭頭所指Numb與α-syn共定位

圖2 Numb與α-syn相互結(jié)合。過(guò)表達(dá)EGFP-Numb的沉降復(fù)合物檢測(cè)到α-syn蛋白

圖3 Numb蛋白促使α-syn蛋白的寡泛素化水平上調(diào)

圖4 Numb蛋白促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的α-syn包涵體形成。與EGFP-N1組對(duì)照，過(guò)表達(dá)Numb的MPP+細(xì)胞模型中α-syn包涵體增多(箭頭所指)(scale bar=20μm)

3 討論

α-synuclein蛋白是由140個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì)，在大腦皮層、海馬、杏仁核和嗅球含量豐富，多集中于神經(jīng)元突觸前末梢、核膜及細(xì)胞質(zhì)中。其生理功能尚不清楚，可能與突觸的可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及高爾基、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。作為帕金森病病理特征的Lewy小體中含有豐富的纖維化的 α-syn蛋白［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，在 α-syn纖維化的過(guò)程中形成的初原纖維化的α-syn及寡聚體具有細(xì)胞毒性，而α-syn寡聚體細(xì)胞毒性更強(qiáng)，致使多巴胺神經(jīng)元損傷，參與帕金森病的病理過(guò)程［4，5］。

泛素是一種含有多個(gè)賴氨酸殘基的小分子蛋白質(zhì)，其功能包括參與細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)、細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等。這些功能都是通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)的泛素化修飾包括多聚泛素化和寡泛素化修飾兩種修飾方式，某些膜蛋白和可溶性蛋白可被單泛素或寡泛素修飾［6］，寡泛素化修飾參與蛋白折疊的調(diào)節(jié)、胞漿運(yùn)輸以及胞吞過(guò)程［7］。Lee等人研究發(fā)現(xiàn)Siah-1可與 α-syn蛋白相互結(jié)合，促進(jìn) α-syn寡泛素化修飾［8，9］。王雪晶等研究發(fā)現(xiàn)BAG5通過(guò)調(diào)節(jié)帕金森相關(guān)Pakin蛋白抑制α-syn泛素化降解，促使 α-syn聚集體增多［10］。Crews等人發(fā)現(xiàn)α-syn蛋白通過(guò)調(diào)控Notch1水平參與了鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生過(guò)程［11］。

Numb是一種進(jìn)化上保守的膜相關(guān)蛋白，是細(xì)胞不對(duì)稱分裂的決定因子，其在神經(jīng)系統(tǒng)及成熟的組織中廣泛存在。Numb與多種信號(hào)通路關(guān)系密切，如Notch、WNT等信號(hào)通路，其中Numb/Notch信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腫瘤的生成等方面研究較多。Susini等人發(fā)現(xiàn)Siah-1蛋白與Numb蛋白相互結(jié)合，并因而促進(jìn)Numb蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解［12］。

Numb蛋白通過(guò)UPS調(diào)節(jié)p53的降解，參與了乳腺癌的病理過(guò)程［13］。Chan SL等人研究發(fā)現(xiàn)Numb蛋白通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放參與了AD發(fā)病過(guò)程，從而為Numb參與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病理過(guò)程提供了理論依據(jù)［14］。Schmit等研究發(fā)現(xiàn)Numb與tubulin存在亞細(xì)胞共定位，Numb與Tubulin相互作用致使 tubulin表達(dá)上調(diào)［15］，Chen L及Esteves AR等人研究發(fā)現(xiàn)tubulin與α-syn存在共定位，在體外實(shí)驗(yàn)中Tubulin可促使α-syn寡聚體積聚，誘導(dǎo) α-syn 包涵體形成［15，16］。由此推測(cè)，Numb可能與α-syn相互作用誘導(dǎo)α-syn包涵體形成從而參與帕金森病的病理過(guò)程。

1-甲基4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyr-idium，MPP+)是神經(jīng)毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)經(jīng)B型單胺氧化酶氧化生成的活性物質(zhì)。MPP+被多巴胺能神經(jīng)元攝取后可抑制線粒體復(fù)合物I的功能，損傷線粒體，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，產(chǎn)生類似PD的臨床表現(xiàn)及病理變化。SH-SY5Y細(xì)胞源于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-NSH細(xì)胞系［17］，具有神經(jīng)突樣的細(xì)胞質(zhì)突起，表達(dá)多巴胺羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體及酪氨酸羥化酶，該細(xì)胞系被廣泛運(yùn)用于PD發(fā)病機(jī)制的研究。MPTP的代謝產(chǎn)物MPP+作用于SH-SY5Y細(xì)胞可以作為研究PD發(fā)病機(jī)制的體外細(xì)胞模型。

在我們研究中，為探求Numb蛋白與α-syn蛋白的泛素化調(diào)控，首先利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Numb與α-syn蛋白的共定位，結(jié)果顯示二者存在亞細(xì)胞共定位。由于蛋白間存在復(fù)雜的相互作用，為進(jìn)一步驗(yàn)證Numb與α-syn的相互作用，我們分別將EGFP-N1或EGFP與HA-α-syn共同轉(zhuǎn)染后利用免疫共沉淀技術(shù)及Western-blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)Numb的沉淀復(fù)合物中檢測(cè)到α-syn蛋白的存在，因此，可證實(shí)二者存在相互結(jié)合。之后，進(jìn)一步研究Numb對(duì)α-syn寡泛素水平的調(diào)控，結(jié)果顯示，EGFP-Numb與HA-α-syn共同轉(zhuǎn)染后，通過(guò)Western blot檢測(cè)證實(shí)Numb上調(diào)了α-syn寡泛素化水平。最后，構(gòu)建MPP+細(xì)胞模型，分別將EGFP-N1、EGFPNumb轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性α-syn包涵體。結(jié)果顯示，與EGFP-N1組對(duì)比，EGFP-Numb組中過(guò)表達(dá)的 Numb促使MPP+誘導(dǎo)的α-syn包涵體的形成。

綜上所述，Numb蛋白上調(diào)α-syn蛋白的寡泛素化水平，并參與誘導(dǎo)α-syn包涵體的形成。這將可能有助于我們尋找阻斷Lewy小體形成的新的干預(yù)靶點(diǎn)，為帕金森病的早期治療提供新的手段。

［1］Conway KA，Lee SJ，Rochet JC，et al.Acceleration of oligomerization，not fibrillization，is ashared property of botha-synuclein mutations linkedto early-onset Parkinson’s disease:Implications for pathogenesis and therapy［J］.PNAS，2000，97(2):571-576.

［2］McGill MA，McGlade CJ.Mammalian numb proteins promote Notch1 receptor ubiquitination and degradation of the Notch1 intracellular domain［J］.Biol Chem，2003，278:23196-23203.

［3］Spillantini MG，Crowther RA，Jakes R，et al.α-SYN in filamentous inclutions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(11):6469-6473.

［4］Bucciantini M，Calloni G，Chiti F，et al.Prefibrillar amyloid protein aggregates share common features of cytotoxicity［J］.Biol Chem，2004，279:31374-31382.

［5］Bodner RA，Outeiro TF，Altmann S，et al.Pharmacological promotion of inclusion formation:a therapeutic approach for Huntington’s and Parkinson’s diseases［J］.PNAS，2006，103(11):4246-4251.

［6］Hicke L，Riezman H.Ubiquitination of a yeast plasma membrane receptor signals its ligand-stimulated endocytosis［J］.Cell，1996，84(2):277-287.

［7］Lucero P，Penalver E，Vela L，et al.Monoubiquitination is sufficient to signal internalization of the maltose transporter in saccharomyces cerevisiae［J］.Bacteriol，2000，182(1):241-243.

［8］Lee JT，Wheeler TC，Chan LS.Ubiquitination ofα-synuclein by Siah-1 promotesα-synuclein aggregation and apoptotic cell death［J］.Hum Mol Genet，2008，17(6):906-917.

［9］王雪晶，郭紀(jì)鋒，江 泓，等.BAG5蛋白與帕金森病相關(guān)蛋白Parkin的相互作用［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2010，35(11):1156-1161.

［10］Susini L，Passer BJ，Telerman A，et al.Siah-1 binds and regulates the function of Numb［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(26):15067-15072.

［11］Chan SL，Pedersen WA，Mattson MP，et al.Numb modifies neuronal vulnerability to amyloidβ-peptide in an isoform-specific manner by a mechanism involving altered calcium homeostasis:implications for neuronal death in Alzheimer’s disease［J］.Neuro Molecular Medicine，2002，1(1):55-67.

［12］Carter S，Vousden KH.A role for Numb in p53 stabilization［J］.Genome Biology，2008，9:221.

［13］Crews L，Mizuno H，Maspliah E，et al.α-synuclein alters Notch-1 expression and neurogenesis in mouse embryonic stem cells and in the hippocampus of transgenic mice［J］.Neuroscience，2008，28(16):4250-4260.

［14］Schmit TL，Nihal M，Ndiaye M，et al.Numb Regulates Stability and Localization of the Mitotic Kinase PLK1 and Is required for Transit through Mitosis［J］.Cancer Res，2012，72(15):3864-3872.

［15］Chen L，Jin J，Davis J，et al.Oligomeric alpha-synuclein inhibits tubulin polymerization［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，356(3):548-553.

［16］Esteves AR，Arduino DM，Swerdlow RH，et al.Microtubule depolymerization potentiates alpha-synuclein oligomerization.Frontiers in Aging［J］.Neuroscience，2010，1(5):1-6.

［17］Biedler JL，Helson K，Spengler BA.Morphology and growth，Tumorigenicity，and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuousculture［J］.Cancer Res，1973，33(11):2643-2652.