左旋精氨酸通過激活L-arg-NO通路對異丙腎上腺素致大鼠心力衰竭的作用

李偉建，方 達(dá)，梁利軍，吳玉蕾，潘睿晗，于 越，劉曉凡，桑黎黎

左旋精氨酸通過激活L-arg-NO通路對異丙腎上腺素致大鼠心力衰竭的作用

李偉建1，方 達(dá)1，梁利軍1，吳玉蕾1，潘睿晗1，于 越1，劉曉凡2，桑黎黎2

目的探究左旋精氨酸（L-arg）通過激活L-arg-NO通路對異丙腎上腺素（ISO）導(dǎo)致的大鼠心力衰竭的保護(hù)作用。方法雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、ISO組、L-arg干預(yù)組。腹腔注射ISO復(fù)制大鼠心力衰竭模型，灌胃給予L-arg。30 d后監(jiān)測血流動力學(xué)參數(shù)：心率（HR）、左室收縮壓力（LVSP）、左室舒張末期壓力（LVEDP）、左室壓力最大上升或下降速率（±dp／dtmax），計(jì)算心肺系數(shù)，檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）含量以及一氧化氮合酶（NOS）活性；HE染色觀察心肌組細(xì)胞排列；Masson染色觀察心肌膠原纖維并計(jì)算心肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)（CVF）。結(jié)果與對照組比較，ISO組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)：HR、LVSP、+dp／dtmax降低，LVEDP、-dp／dtmax升高，心肺系數(shù)增加，血清TNF-α、SOD升高，NO、NOS降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。L-arg干預(yù)組HR、LVSP、+dp／dtmax均高于ISO組，LVEDP、-dp／dtmax、心肺系數(shù)低于ISO組，血清SOD和TNF-α降低，NO和NOS增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色顯示對照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，間質(zhì)無擴(kuò)張充血，心肌細(xì)胞排列整齊；ISO組心肌細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，而L-arg干預(yù)組心肌細(xì)胞接近對照組。ISO組Masson染色心肌細(xì)胞間可見大量藍(lán)染的膠原纖維，而對照組觀察不到藍(lán)染區(qū)域，L-arg干預(yù)組在對照組與ISO組之間；ISO組CVF明顯高于L-arg干預(yù)組（P＜0.05），L-arg干預(yù)組高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論L-arg可以通過激活L-arg-NO通路，增加機(jī)體內(nèi)NO含量，改善血流，減輕心肌重構(gòu)，產(chǎn)生對心力衰竭心肌的保護(hù)作用。

左旋精氨酸；L-arg-NO通路；異丙腎上腺素；心力衰竭

心力衰竭是一種臨床上常見的嚴(yán)重的心血管疾病，其主要是由心肌細(xì)胞、心內(nèi)膜或大血管、心包膜異常引起；然而絕大多數(shù)情況下，心力衰竭的發(fā)生都與心肌細(xì)胞功能的損害有關(guān)［1］。一氧化氮（nitric oxide，NO）是人體多種細(xì)胞均可以產(chǎn)生的自由基，在全身各處分布廣泛。左旋精氨酸（L-arginine，L-arg）作為NO的前體可通過抗氧自由基、改善心肌能量代謝、增加冠狀動脈血流量和抑制中性粒細(xì)胞聚集等具有對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用［2］。提供外源性的L-arg可以拮抗脂質(zhì)過氧化，減輕心臟缺血-再灌注損傷［3-4］；改變心臟移植物血管病變，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，保持內(nèi)皮功能穩(wěn)定［5］；降低血脂膽固醇，阻止動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展，減少高膽固醇血癥和冠心病心絞痛的發(fā)生［6］；對血壓調(diào)節(jié)，高血壓治療等方面的效果都較為肯定，在臨床上應(yīng)用廣泛［7-8］。然而目前國內(nèi)外對于L-arg治療心力衰竭的研究報(bào)道甚少，該實(shí)驗(yàn)研究L-arg干預(yù)對心力衰竭心肌細(xì)胞功能的影響以及一氧化氮合酶（nitric oxide syntheses，NOS）活性的變化，探討L-arg對心力衰竭心肌的作用，從而為L-arg的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠，重（220± 20）g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。每6只分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 L-arg購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、NO、NOS試劑盒均購自南京建成生物有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）測定試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Power Lab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司）；電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；128ce酶標(biāo)儀（澳大利亞Clinibio公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與心衰模型制作 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、ISO組、L-arg干預(yù)組，每組8只。①對照組：大鼠腹腔注射生理鹽水3 ml／kg，早晚各1次；第2次腹腔注射生理鹽水后灌胃1 ml／（kg·d）蒸餾水；②ISO組：大鼠腹腔注射ISO 3 mg／kg，2次／d［9］，早晚各1次，第2次腹腔注射ISO后灌胃1 ml／（kg·d）蒸餾水；③L-arg干預(yù)組：大鼠腹腔注射ISO 3 mg／kg，2次／d，早晚各1次，第2次腹腔注射ISO后灌胃L-arg 250 mg／（kg·d）［10］。以上操作每天1次，各組腹腔注射10 d，灌胃30 d后實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 左室血流動力學(xué)監(jiān)測 灌胃30 d后的次日，將各組大鼠稱重、麻醉、固定、頸部剪毛備皮。取頸正中縱行切開，經(jīng)頸總動脈將連有壓力換能器的充滿肝素的導(dǎo)管插入左心室。壓力信號由壓力換能器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栞斎隤ower Lab生物信號采集系統(tǒng)，Chart 7.0軟件記錄心率（heart rate，HR）、左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室內(nèi)壓上升或下降的最大變化速率（maximal or minimal differentials of left ventricular developed pressure，±dp／dtmax）。各組大鼠監(jiān)測30 min，監(jiān)測完成后頸總動脈取血2 ml，4℃條件下3 000 r／min，離心15 min，取上層血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 心肺系數(shù)測定 取血完成后立即開胸，切除大鼠心臟和肺并在冰生理鹽水中漂洗直至生理鹽水變得澄清，濾紙拭干，用電子天平稱重大鼠心臟和肺并記錄數(shù)值，計(jì)算各組大鼠心肺系數(shù)［心重（mg）／體重（g），肺重（mg）／體重（g）］。

1.2.4 血清TNF-α、SOD、NO和NOS的測定 取已保存的上層血清，按試劑盒說明書分別測定TNF-α、SOD、NO和NOS含量。TNF-α測定采用ELISA法，SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，NO測定采用硝酸還原法，NOS活性測定采用比色法。

1.2.5 HE染色方法 切取左心室大部分組織，置于10%的甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。染色時(shí)，提前將片子置于60℃培養(yǎng)箱加熱過夜，后行脫蠟HE染色并進(jìn)行顯微鏡下觀察。

1.2.6 Masson染色和膠原纖維容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）測定 在100倍顯微鏡下觀察心肌組織切片Masson染色后，膠原纖維與細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，心肌細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色。將Masson染色在400倍鏡下隨機(jī)選擇4個(gè)視野，血管膠原聚集的區(qū)域邊界不包括在內(nèi)，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，軟件可以直接計(jì)算出CVF。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均采用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和血流動力學(xué)參數(shù)變化與對照組比較，ISO組HR、LVSP、+dp／dtmax降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；LVEDP、-dp／dtmax升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與ISO組比較，L-arg干預(yù)組HR、LVSP、+dp／dtmax升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而LVEDP、-dp／dtmax明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 心肺系數(shù)與對照組比較，ISO組大鼠心臟和肺系數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與ISO組比較，L-arg干預(yù)組心臟和肺系數(shù)低于ISO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 L-arg干預(yù)對血清SOD、TNF-α、NO和NOS水平的影響與對照組比較，ISO組SOD含量和TNF-α水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與ISO組比較，L-arg干預(yù)組SOD含量和TNF-α水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、3。與對照組比較，ISO組NO含量和NOS活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ISO組比較，L-arg干預(yù)組NO含量和NOS活性均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)的比較（）

表1 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)的比較（）

與對照組比較：**P＜0.01；與ISO組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項(xiàng)目對照組（n＝8）ISO組（n＝8）L-arg干預(yù)組（n＝8）F值P值第1天體重（g）208±12210±10206±14--第30天體重（g）280±16253±18272±15--HR（次／min）390±8.97321±11.30**382±9.56＃＃14.320.000 1 LVSP（kPa）13.63±0.619.87±0.77**12.84±0.44＃10.650.000 6 LVEDP（kPa）0.43±0.101.26±0.14**0.71±0.15＃10.620.000 6 +dp／dtmax（kPa／s）337.33±13.07300.93±12.40318.67±14.13＃13.270.000 1 -dp／dtmax（kPa／s）328.40±12.00285.73±11.33**313.73±12.67＃＃23.110.000 1

2.4 心臟HE染色觀察對照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)正常，胞質(zhì)染色均勻，間質(zhì)無擴(kuò)張充血，心肌纖維整齊排列，心肌橫紋排列清晰，無顯著異常。ISO組大鼠心肌細(xì)胞具有不同程度的病理變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞肥大、壞死、凋亡，炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞斷裂、扭曲，心肌橫紋模糊。L-arg干預(yù)組心肌細(xì)胞排列整齊無病理變化，與對照組基本相似。見圖5。

2.5 Masson染色和心肌CVFISO組Masson染色心肌細(xì)胞間可見大量藍(lán)染的膠原纖維，而對照組觀察不到藍(lán)染區(qū)域，L-arg干預(yù)組在對照組與ISO組之間。與對照組比較，ISO組CVF明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，L-arg干預(yù)組心肌CVF明顯降低（P＜0.05），3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.05，P＜0.05）。見圖6、7。

3 討論

心力衰竭是許多心血管疾病，如冠心病、高血壓、心臟病、嚴(yán)重心律失常等的終末階段和最主要的死因，是一種嚴(yán)重的臨床癥狀綜合征［11］，其中心肌損傷和重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭的最主要原因。因此，探討心肌損害的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的防治措施，具有重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射ISO制作心力衰竭模型，心肺系數(shù)明顯增加，有創(chuàng)血流動力學(xué)異常，HE染色切片觀察心肌細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，Masson染色觀察間質(zhì)膠原纖維增加，說明心衰時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生了重構(gòu)，這些均表明心力衰竭模型復(fù)制成功。TNF-α來自于巨噬細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生心力衰竭心肌損傷時(shí)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α參與炎癥反應(yīng)，因此，測定血清TNF-α含量可以反映心肌損傷程度［12］。SOD的心肌毒性，主要是和氧自由基損傷、細(xì)胞凋亡、鈣超載等因素相關(guān)［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ISO誘發(fā)心臟衰竭的同時(shí)，增強(qiáng)血清SOD活性，增加TNF-α的含量，這表明ISO誘導(dǎo)心肌損傷的同時(shí)，造成強(qiáng)烈的心肌組織脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生大量的自由基，損傷心肌組織。心力衰竭的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是心肌排列紊亂，大量炎性滲出和纖維增生，HE染色下，與對照組比較，ISO組中心肌細(xì)胞排列紊亂，有大量的心肌纖維增生并伴有炎性細(xì)胞滲出。Masson染色提示ISO組在排列紊亂的心肌細(xì)胞間有大量藍(lán)染膠原纖維增生，CVF亦提示模型組有較高心肌纖維增生。

近年來，隨著L-arg對心臟疾病的作用研究開展增多，有助于更進(jìn)一步了解心肌疾病的發(fā)生機(jī)制，尋找新的治療方法。L-arg-NO通路，即L-arg在NOS的催化作用下生成L-瓜氨酸和NO。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L-arg干預(yù)后明顯降低心肺參數(shù)，改善血流動力學(xué)參數(shù)，同時(shí)減輕心肌排列紊亂程度和膠原纖維增生，表明其對心力衰竭心肌有明顯的改善作用。心力衰竭時(shí)血清中的NO含量和NOS活性均降低，L-arg干預(yù)后，提高NO含量，增強(qiáng)NOS的活性。在正常生理情況下，心肌細(xì)胞表達(dá)的NOS以精氨酸為底物生成NO，NO擴(kuò)散進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞后，在細(xì)胞中影響有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯水平以及線粒體的氧化磷酸化功能，進(jìn)而減輕心肌損害，產(chǎn)生保護(hù)心肌的作用［14］。與對照組比較，ISO增強(qiáng)SOD活性和TNF-α含量，增加心肌排列紊亂程度和膠原纖維含量，而L-arg顯著減輕上述改變。推測L-arg通過促進(jìn)NO的產(chǎn)生，中和氧自由基，降低過氧亞硝酸陰離子生成，增強(qiáng)膜穩(wěn)定和心肌收縮力，減輕心肌重構(gòu)等方面保護(hù)心力衰竭心肌細(xì)胞。

綜上所述，提供外源性L-arg增強(qiáng)NOS活性，可以通過激活L-arg-NO通路，提高體內(nèi)NO濃度，減輕心肌損害和重構(gòu)，從而改善心力衰竭造成的心肌損害，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

［1］ 汪 兵，吳繼雄，王曉晨，等.慢性心力衰竭患者血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ與心臟結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系及其對預(yù)后的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（6）：652-5.

［2］ Mohamed Abd-H，Lasheen N N.Comparative study on the protective role of vitamin C and L-arginine in experimental renal ischemia reperfusion in adult rats［J］.Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2014，6（3）：153-65.

［3］ Tratsiakovich Y，Gonon A T，Kiss A，et al.Myocardial protection by co-administration of L-arginine and tetrahydrobiopterin during ischemia and reperfusion［J］.Int J Cardiol，2013，169（1）：83-8.

［4］ Senbel A M，Omar A G，Abdel-Moneim L M，et al.Evaluation of L-arginine on kidney function and vascular reactivity following ischemic injury in rats：protective effects and potential interactions［J］.Pharmacol Rep，2014，66（6）：976-83.

［5］ Martens C R，Kuczmarski J M，Kim J，et al.Voluntary wheel running augments aortic L-arginine transport and endothelial function in rats with chronic kidney disease［J］.Am J Physiol Renal Physio，2014，307（4）：F418-26.

［6］ Hayashi T.The role of L-arginine and L-citrulline on atherosclerosis［J］.Seikagaku，2014，86（3）：352-9.

［7］ Dong J Y，Qin L Q，Zhang Z，et al.Effect of oral L-arginine supplementation on blood pressure：a meta-analysis of randomized，double-blind，placebo-controlled trials［J］.Am Heart J，2011，162（6）：959-65.

［8］ Sandbakk S B，Sandbakk ?，Peacock O，et al.Effects of acute supplementation of L-arginine and nitrate on endurance and sprint performance in elite athletes［J］.Nitric Oxide，2015，48：10-5.

［9］ 楊玲玲，張鈺哲，吳建新.異丙腎上腺素復(fù)制大鼠心衰模型及對心功能影響初探［J］.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2012，25（10）：1141 -2.

［10］岳冠華，閏 健，李承道.補(bǔ)充NO前體左旋精氨酸對一次性力竭運(yùn)動大鼠心肌的影響［J］.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（1）：81-5.

［11］程 寅，馮媛媛.老年維吾爾族慢性心力衰竭患者N末端腦鈉肽前體變化［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（7）：828-31.

［12］Torre-Amione A G，Vooletich M T，F(xiàn)armer J A.Role of tumor necrosis factor-alpha in the progression of heart failure：therapeutic implications［J］.Drugs，2000，59（4）：745-51.

［13］Meldrum D R.Tumor necrosis factor in the heart［J］.Am J Physiol，1998，274（3 Pt 2）：R577-95.

［14］Williams D，Venardos K M，Byrne M，et al.Abnormal mitochondrial L-arginine transport contributes to the pathogenesis of heart failure and rexoygenation injury［J］.PLoS One，2014，9（8）：e104643.

The effects of L-arginine on heart failure rats induced by isoprenaline through activating L-arg-NO pathway

Li Weijian，F(xiàn)ang Da，Liang Lijun，et al

（Clinical Medicine，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002）

ObjectiveTo explore the effects of L-arginine（L-arg）by activating L-arg-NO pathway on heart failure rats induced by isoprenaline（ISO）.MethodsMale SD rats were randomly divided into three groups：control group，ISO group，L-arg group.Heart failure model was made by injecting ISO and L-arg was given by gavage.After thirty days，each group was monitored with hemodynamic parameters by carotid artery intubation：heart rate（HR），left ventricular systolic pressure（LVSP），left ventricular end-diastolic pressure（LVEDP），maximal or minimal differentials of left ventricular developed pressure（±dp／dtmax）.Heart and lung indices were calculated.Superoxide dismutase（SOD），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and nitric oxide（NO）concentration and nitric oxide syntheses（NOS）activity in plasma of each group were determined.Myocardial tissue changes were analyzed by HE staining.Myocardial fibers changes and collagen volume fraction（CVF）were analyzed by Masson trichrome staining.ResultsHR，LVSP and+dp／dtmaxin L-arg group were higher than those in ISO group；LVEDP and -dp／dtmaxin L-arg group were lower than that in ISO group（P＜0.05）.L-arg decreased the heart and lung indices（P＜0.05）.Meanwhile，the TNF-α and SOD level of L-arg group were decreased than those of ISO group（P＜0.05）.At the same time，the NO concentration and NOS activity of L-arg increased than those of ISO group（P＜0.05）.The myocardial arranged disorder，lots of inflammatory cells and interstitial collagen due to isoprenaline injection，L-arg supplements improved the heart function induced by ISO.There were a large number of blue-stained collagen fibers among derangement of myocardial cells in ISO group.But there was rarely the blue-stained region in the control group and L-arg group.CVF in ISO group was higher than L-arg group（P＜0.05），CVF in L-arg group was higher than the control group（P＜0.05）.ConclusionExogenous L-arg can protect heart failure myocardium through activating L-arg-NO pathway to activate NOS，increase NO concentration，reduce myocardial remodeling and improve cardiac function.

L-arg；L-arg-NO pathway；isoprenaline；heart failure

R 364.31

A

1000-1492（2015）12-1716-05

時(shí)間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.004.html

2015-08-10接收

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201410313056X）；徐州醫(yī)學(xué)院院級科研課題（編號：2014KJ11）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：20130313021）

徐州醫(yī)學(xué)院1臨床醫(yī)學(xué)系、2機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，徐州 221002作者簡介：李偉建，男，本科生；

桑黎黎，女，實(shí)驗(yàn)師，責(zé)任作者，E-mail：sanglili1982＠163.com