馬鈴薯絲核菌病生防菌株篩選及其拮抗作用研究

劉宇帥，曹 旭，陳靜宇，孟利強，張淑梅，胡基華，姜 威，李 晶*

(1．黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱150001;2．黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010)

近年來馬鈴薯產業(yè)發(fā)展迅速，種植面積不斷擴大，但同時馬鈴薯病害日趨嚴重，馬鈴薯絲核菌病就是其中之一，該病不僅發(fā)病普遍，危害程度也越來越重，嚴重者可達5%左右，降低20%的產量，并影響品質，該病害已成為馬鈴薯產業(yè)發(fā)展的一大障礙［1］。馬鈴薯絲核菌病又稱黑痣病、絲核菌潰瘍病，病原菌是一種真菌，其無性階段是立枯絲核菌。該病原菌寄主范圍廣泛，在全世界的耕作及非耕作土壤中均有分布，許多絲核菌很容易從染病植株及土壤中分離得到。該病原菌易引起植物爛種、苗期猝倒，在土壤中的腐生競爭力強，存活時間長，其菌核在塊莖上或土壤中越冬，次年根據環(huán)境條件又可發(fā)生侵染。因此，馬鈴薯絲核菌病是一種種薯帶病和土壤傳播相結合的病害，從而給防治帶來很大困難［2－5］。

馬鈴薯絲核菌病的傳統(tǒng)防治方法主要有農業(yè)防治和化學防治。近年來，由于傳統(tǒng)的農業(yè)防治方法不能從根本上控制病害的發(fā)生，防治效果往往不穩(wěn)定;而化學農藥的長期使用會使病原菌產生抗藥性，過量使用農藥還會破壞土壤的微生態(tài)環(huán)境，加重農藥對環(huán)境的污染，造成有毒有害物質在農作物體內過多殘留。因此，生物防治方法的研究越來越受到人們的重視，如利用微生物之間的拮抗作用，選擇對農作物不造成危害的微生物來抑制病原菌的生長［6］。為此，筆者篩選了對馬鈴薯絲核病菌具有拮抗作用的生防菌，并對其拮抗作用機制進行了初步研究，旨在為馬鈴薯絲核菌病的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試菌。馬鈴薯絲核病菌由黑龍江省農業(yè)科學院植物脫毒苗木研究所贈送，供試驗篩選所用細菌均為實驗室保藏的生防菌株。

1．1．2 培養(yǎng)基。NYD 培養(yǎng)基:牛肉浸膏8．0 g，酵母膏5．0 g，葡萄糖10．0 g，蒸餾水1 000 ml，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂15．0 g，pH7．2 ～ 7．5;PD 培養(yǎng)基:馬鈴薯 200．0 g，葡萄糖20．0 g，蒸餾水 1 000 ml，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂 15．0 g，pH7．2 ～7．5;黑麥液體培養(yǎng)基:黑麥 100．0 g，蔗糖 15．0 g，碳酸鈣 1．4 g，蒸餾水 1 000 ml，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂 15．0 g。

1．2 方法

1．2．1 生防菌株的篩選。

1．2．1．1 初篩。對實驗室現有保藏的生防細菌菌株(CZS、LKS、WHS、PB12、B10、CZL、ZH2、B29、JK)挑取單菌落，分別接于5 ml NYD試管中，于35℃、170 r/min振蕩器中培養(yǎng)18 h待用。將保存在斜面上的馬鈴薯絲核病菌接PDA平板，置于28℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿。在PDA培養(yǎng)基平板上劃十字線分出4個區(qū)域，每個區(qū)域中心分別接入直徑為8 mm的靶標病原菌菌餅，同時在平板十字線上劃入待測生防菌液，設無生防菌液為對照，4次重復，于25℃下培養(yǎng)，當對照真菌長至十字線位置時觀察處理組抑菌效果。

1．2．1．2 復篩。經過初篩獲得7株具有拮抗作用的細菌，采用“1．2．1．1”方法繼續(xù)進行復篩，當對照真菌長至十字線位置時觀察處理組抑菌效果。測量抑菌帶寬，計算抑菌率。將抑菌效果大于50%的生防菌進行純化保藏。

抑菌率=(對照菌絲直徑－處理菌絲直徑)/對照菌絲直徑×100%

1．2．2 生防菌株的拮抗作用測定。對具有較強拮抗效果的2株生防細菌挑取單菌落，分別接于5 ml NYD試管中，于30℃、150 r/min振蕩器中培養(yǎng)24 h。再以2%的接種量分別接種于50 ml NYD三角瓶中，于30℃、150 r/min振蕩器中培養(yǎng)45 h待用。將保存的馬鈴薯絲核病菌接于PDA平板，置于28℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)皿。

1．2．2．1 液體培養(yǎng)條件下的拮抗作用測定。將PB12與CZS菌液分別進行10倍、100倍梯度稀釋，然后在50 ml PD液體培養(yǎng)瓶中以2%的接種量分別加入細菌原液及各稀釋度菌液1 ml。再于每瓶中分別接入直徑為8 mm的靶標病原菌菌餅，設未接種生防菌液為對照，3次重復，置于28℃恒溫搖床上培養(yǎng)。每天對真菌生長情況進行觀察，到第4天停止培養(yǎng)，此時對照組真菌生長量明顯多于試驗組。將菌絲過濾，置于陰涼干燥處晾干后稱其干重，并計算抑菌率。

抑菌率=(對照菌絲重量－處理菌絲重量)/對照菌絲重量×100%

1．2．2．2 固體培養(yǎng)條件下的拮抗作用測定。將PB12與CZS菌液分別進行10倍、100倍梯度稀釋，然后在PDA培養(yǎng)基平板上均勻涂滿細菌原液及各稀釋度菌液100μl。晾干后每平板分別接入直徑為8 mm的靶標病原菌菌餅，設未涂生防菌液為對照，3次重復，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天對真菌生長情況進行觀察，測量菌絲直徑，并計算抑菌率。

抑菌率=(對照菌絲直徑－處理菌絲直徑)/對照菌絲直徑×100%

1．2．2．3 生防菌對馬鈴薯絲核病菌菌核形成的影響。將PB12與CZS菌液分別進行10倍、100倍梯度稀釋，然后在PDA培養(yǎng)基平板上均勻涂滿各濃度的菌液100μl(包括細菌原液及各稀釋度菌液)。晾干后每平板分別接入直徑為8 mm的靶標病原菌菌餅，設未涂生防菌液為對照，3次重復，于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期對菌核形成情況進行觀察。

2 結果與分析

2．1 馬鈴薯絲核菌病生防菌的篩選 通過平板抑菌對峙試驗對實驗室現有生防菌株的抑菌能力進行測定，篩選出7株抑菌能力不同的細菌。其中，菌株PB12和CZS的抑菌效果較明顯，通過對抑菌帶寬度的測量可知，菌株PB12的抑菌率為59．82%，菌株 CZS 為56．37%(表1)。

2．2 菌株PB12、CZS對絲核菌的拮抗作用

2．2．1 液體培養(yǎng)條件下的拮抗作用。通過共培養(yǎng)的方法對菌株PB12、CZS的拮抗作用進行測定，結果表明在液體培養(yǎng)條件下，對照組中絲核菌菌絲迅速生長成團塊，而加有生防菌株的培養(yǎng)瓶內菌絲生長緩慢。第4天時停止培養(yǎng)，將各組菌絲進行過濾、晾干、稱重。由圖1可知，對照組菌絲團塊明顯大于各試驗組菌絲團塊，同時隨著稀釋度的增加，試驗組團塊的大小無明顯變化。通過計算各組菌絲團塊的重量表明，菌株PB12和CZS均能夠抑制馬鈴薯絲核病菌菌絲的生長，抑菌率達到98．00%。不同濃度的生防菌液(原液、稀釋10倍和100倍)對抑菌效果影響較小(表2)。

表1 供試菌株對絲核菌的防治效果

2．2．2 固體培養(yǎng)條件下的拮抗作用。通過平板抑菌試驗對菌株PB12、CZS的拮抗作用進行測定，結果表明在固體培養(yǎng)條件下，對照組中絲核菌菌絲逐漸生長且菌絲致密、健壯，而涂有生防菌株的培養(yǎng)皿內菌絲生長緩慢，當培養(yǎng)至第3天時對照組菌絲長滿整個平板，試驗組各菌絲稀疏，長勢明顯弱于對照組，在培養(yǎng)中后期幾乎不再生長(圖2)。通過對菌絲直徑計算表明，菌株PB12和CZS對馬鈴薯絲核菌的抑菌率雖然沒有液體條件下的抑菌率高，但幾乎可達到60%以上，且隨著培養(yǎng)時間的延長抑菌能力逐漸升高，其中菌株PB12的抑菌率可達到79．82%。不同濃度的生防菌液(原液、稀釋10倍和100倍)對抑菌效果存在影響，隨著稀釋度的增加抑菌能力下降(表3)。

表2 液體培養(yǎng)條件下絲核菌生防菌株PB12與CZS的拮抗效果

2．2．3 生防菌對馬鈴薯絲核病菌菌核形成的影響。菌核是由菌絲緊密連接交織而成的休眠體，能夠抵御外界不良環(huán)境。當環(huán)境適宜時，菌核能萌發(fā)產生新的營養(yǎng)菌絲或從上面形成新的繁殖體。試驗結果表明，培養(yǎng)到第14天時，對照組開始形成黑色菌核，隨著培養(yǎng)時間的延長菌核逐漸變大、增多、大小不一、具有光澤且都聚集在菌落中心。而整個培養(yǎng)期間涂有不同濃度生防菌液(原液、稀釋10倍和100倍)的各試驗組均未發(fā)現菌核的形成(圖3)。因此，生防菌PB12和CZS在抑制馬鈴薯絲核菌菌絲正常生長的同時也抑制了其菌核的形成，削弱了絲核菌抵御不良環(huán)境的能力。

表3 固體培養(yǎng)條件下絲核菌生防菌株PB12與CZS的拮抗效果

3 結論與討論

該研究篩選出2株對馬鈴薯絲核病菌抑菌率達98%的生防菌株PB12和CZS，通過抑菌試驗表明，無論是在液體培養(yǎng)條件下還是固體培養(yǎng)條件下，菌株PB12和CZS對馬鈴薯絲核病菌的拮抗作用都十分穩(wěn)定，在液體培養(yǎng)時生防菌液稀釋度的變化對抑菌效果無明顯影響，在固體培養(yǎng)時隨著生防菌液稀釋度的增加抑菌能力稍有下降，同時該2株生防菌均可抑制絲核病菌菌核的形成，削弱絲核菌抵御外界不良環(huán)境的能力。

利用微生物之間的拮抗作用防治植物病害的研究較多［7］，但目前國內對馬鈴薯絲核菌病害的報道多集中于病原菌的生物學特性、傳播以及化學防治方面，對該病原菌生物防治的報道很少。植物病害的防治受植物、病原物、拮抗菌、環(huán)境條件等多方面因素的影響［8］。有研究表明，病原菌立枯絲核菌是一種全世界大量農作物和野生寄主的病原物，當該病菌侵染到馬鈴薯上，隨著土壤濕度的增大，新薯塊上的菌核形成會加重。新塊莖上形成的菌核或在土壤中越冬的菌核次年根據環(huán)境條件又可發(fā)生侵染，給防治帶來很大困難［3］。

該研究篩選出的生防菌株PB12和CZS對馬鈴薯絲核病菌具有較強的拮抗作用，對病原菌菌絲有抑制作用，更重要的是能夠顯著抑制馬鈴薯絲核菌菌核的形成，表現出防治菌核病的潛力，可提高馬鈴薯產量及品質，具有進一步研究的價值。針對該2株生防菌的抗菌機理、在馬鈴薯活體上是否具有相同的拮抗作用以及田間防效等試驗將在后續(xù)研究中進行。

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［5］劉力，葛起新．華東地區(qū)立枯絲核菌融合群鑒定［J］．浙江農業(yè)大學學報，1987，13(3):3 －9．

［6］張?zhí)鞎?，張志光．立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kühn的研究［J］．湖南師范大學自然科學學報，1986，9(1):76－82．

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［8］HANY X，HUBJ，WANGGN．Control efficacy and antifungal mechanism of Bacilluscereus strain JK14 against wheat takeall disease［J］．Agricultural science ＆ technology，2008，9(1):70－74．