豬繁殖與呼吸綜合征毒株在Vero細(xì)胞上的增殖驗(yàn)證試驗(yàn)

陳曉春，吳華偉，王繼文，鄧 永，郎洪武，高金源?，吳曉薇

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京100026；3.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州510623）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）自 1987年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。特別是以高熱、高發(fā)病率和死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征已成為長(zhǎng)期危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大動(dòng)物疫病之一。疫苗接種是預(yù)防PRRSV疫情發(fā)生的最有效途徑之一。建立科學(xué)、有效、規(guī)范的疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)體系在疫病防控中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。大量數(shù)據(jù)已證實(shí)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）能在豬原代肺泡巨噬細(xì)胞、傳代細(xì)胞 Marc145、MA104、CL11171、CL-2621、HSo2H上生長(zhǎng)，只是不同毒株在細(xì)胞上的增殖效率存在一定的差異［2］，而關(guān)于PRRSV在Vero細(xì)胞上的增殖存在異議［3-4］，且相關(guān)報(bào)道和文獻(xiàn)較少。目前，由于國(guó)內(nèi)各企業(yè)對(duì)于PRRSV能否在Vero等細(xì)胞上增殖認(rèn)識(shí)不一，且高效、特異的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽(yáng)性血清制備困難，使得某些企業(yè)往往對(duì)樣品不進(jìn)行特異性血清中和處理便進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，存在干擾真實(shí)檢驗(yàn)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。為驗(yàn)證PRRSV在Vero細(xì)胞上的增殖情況，本研究將我國(guó)目前5個(gè)不同的PRRSV活疫苗毒株分別接種Vero細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞病變觀察和熒光抗體檢查確定其增殖效果，為規(guī)范PRRSV活疫苗檢驗(yàn)、保障疫苗質(zhì)量和豬繁殖與呼吸綜合征疫病防控提供有益的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R株）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗（TJM-F92株）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗（HuN4-F112株）、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（CH-1R株）、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（R98株）各1批，每批3瓶，均為符合GMP要求的批簽發(fā)合格產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞 Vero細(xì)胞由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.1.3 試劑 DMEM營(yíng)養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的抗PRRSV單克隆抗體為Bio X Diagnostics公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 接種 分別取5種疫苗各3瓶，用不含血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液分別稀釋為含10頭份／mL，同批苗混合均勻后8000 r／min離心10 min，取上清液接種已長(zhǎng)滿80%Vero細(xì)胞單層的25 cm2細(xì)胞瓶各2瓶，每瓶接種1 mL，37℃吸附1 h，棄掉吸附液，用PBS洗滌1次后補(bǔ)加10 mL含2%胎牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。如出現(xiàn)80%細(xì)胞病變，則收獲病毒液。如未見(jiàn)細(xì)胞病變，則在培養(yǎng)5 d后收獲培養(yǎng)物。

1.2.2 繼代 將上述收獲的培養(yǎng)物置-70℃凍融3次，3000 r／min離心10 min，取上清液如1.2.1項(xiàng)方法接種Vero細(xì)胞，如此繼代，使總培養(yǎng)時(shí)間達(dá)14 d以上。最后一次繼代時(shí)每個(gè)樣品分別接種25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶2瓶和96孔細(xì)胞板20孔，37℃培養(yǎng)5～7 d，觀察細(xì)胞CPE情況，并進(jìn)行熒光抗體染色。

1.2.3 熒光抗體染色 取1.2.2項(xiàng)中最后一次繼代的96孔細(xì)胞板，棄上清，PBS洗滌2次，用80%丙酮在2～8℃條件下固定20 min，自然干燥后按常規(guī)方法進(jìn)行熒光染色，并置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病變觀察結(jié)果 5種疫苗在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)，均能產(chǎn)生特異性CPE。其中TJM-F92株 PRRSV、HuN4-F112株 PRRSV、CH-1R 株P(guān)RRSV在接種的第1代（總培養(yǎng)時(shí)間第3天）即出現(xiàn)典型的CPE，JXA1-R株P(guān)RRSV在第2代（總培養(yǎng)時(shí)間第8天）開(kāi)始出現(xiàn)典型CPE，R98株P(guān)RRSV在第3代（總培養(yǎng)時(shí)間第13天）開(kāi)始出現(xiàn)典型CPE，病變細(xì)胞開(kāi)始表現(xiàn)為圓縮，部分聚集且周?chē)?xì)胞變形、界限模糊，48 h左右病變細(xì)胞圓縮脫落可達(dá)80%以上（圖2～圖6）。

2.2 熒光抗體染色結(jié)果 5種疫苗樣品在Vero細(xì)胞上的第3代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)FITC標(biāo)記的抗PRRSV單克隆抗體熒光染色，在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見(jiàn)特異性翠綠色熒光（圖8～圖12），對(duì)照細(xì)胞未見(jiàn)熒光且背景純凈（圖7）。

圖1 正常Vero細(xì)胞對(duì)照（×200，下同）

圖2 PRRSV CH-1R株病變情況

圖3 PRRSV JXA1-R株病變情況圖

圖4 PRRSV HuN4-F112株病變情況

圖5 PRRSV TJM-F92株病變情況

圖6 PRRSV R98株病變情況

圖7 Vero細(xì)胞對(duì)照（×200，下同）

圖8 PRRSV CH-1R株熒光檢測(cè)結(jié)果

圖9 PRRSV JXA1-R株熒光檢測(cè)結(jié)果

圖10 PRRSV HuN4-F112株熒光檢測(cè)結(jié)果

圖11 PRRSV TJM-F92株熒光檢測(cè)結(jié)果

圖12 PRRSV R98株熒光檢測(cè)結(jié)果

3 討論

《中華人民共和國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定［5］，在豬用病毒類活疫苗的外源病毒檢驗(yàn)中，均應(yīng)使用Vero細(xì)胞進(jìn)行致細(xì)胞病變作用（CPE）和紅細(xì)胞吸附性試驗(yàn)。對(duì)于“樣品處理”除另有規(guī)定外，應(yīng)對(duì)待檢毒種或活疫苗用相應(yīng)的特異性抗血清中和后作為檢品進(jìn)行檢驗(yàn)。但在實(shí)際檢驗(yàn)中，為簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)約檢驗(yàn)材料，若疫苗抗原在該檢驗(yàn)細(xì)胞上不能增殖或能夠增殖但無(wú)致細(xì)胞病變作用（CPE）且無(wú)紅細(xì)胞吸附作用，可以不用特異性抗血清對(duì)疫苗進(jìn)行中和，即可進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)。美國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)9CFR113.300也有相似規(guī)定［6］。本研究將目前國(guó)內(nèi)用于豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗生產(chǎn)的5個(gè)毒株未經(jīng)中和接種Vero細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該5個(gè)毒株均能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，培養(yǎng)物經(jīng)FITC標(biāo)記的PRRSV單克隆抗體檢測(cè)，在胞漿內(nèi)也能觀察到特異性熒光。結(jié)果提示在進(jìn)行這5個(gè)毒株相關(guān)產(chǎn)品的外源病毒檢驗(yàn)時(shí)，需要進(jìn)行特異性血清中和才能接種Vero細(xì)胞，否則在傳代過(guò)程中造成的CPE會(huì)影響到外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果的判定。另外，目前WTO已批準(zhǔn)了Vero細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的使用，而Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)也已成功應(yīng)用于流感病毒、狂犬病毒、乙型腦炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腸道病毒、漢他病毒、牛呼吸道合胞體病毒的培養(yǎng)［7-10］。與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比，該技術(shù)具有產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、易操控、易放大、成本低等優(yōu)點(diǎn)。作為我國(guó)重要的動(dòng)物傳染病之一，PRRSV疫苗生產(chǎn)也應(yīng)尋求可以替代傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的低效能生產(chǎn)模式的新技術(shù)新工藝，以有效發(fā)揮疫苗在我國(guó)防控政策中的基礎(chǔ)性作用。該研究初步證實(shí)了PRRSV能在Vero細(xì)胞上增殖，這就提示將Vero細(xì)胞的微載體培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于PRRSV疫苗生產(chǎn)存在一定的可行性，進(jìn)一步優(yōu)化PRRSV疫苗微載體培養(yǎng)工藝將極大提升其生產(chǎn)水平。

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