布比卡因?qū)Ω咛桥囵B(yǎng)SH-SY5Y 細胞毒性研究＊

李亞文，徐世元，張慶國，李 樂，賴露穎，鄭 艇，蘇嬌玲，楊耐梅，李元濤

（1.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院麻醉科，廣州510282；2.南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院麻醉科，廣東深圳518028）

研究證實糖尿病患者接受椎管內(nèi)阻滯麻醉或鎮(zhèn)痛后，其發(fā)生神經(jīng)損傷的風險明顯增加，或加重原有多發(fā)性神經(jīng)病變。而產(chǎn)婦妊娠期糖尿病發(fā)生率呈增高趨勢［1］，此類患者可能類同于糖尿病患者，采用椎管內(nèi)阻滯麻醉或鎮(zhèn)痛可增加神經(jīng)損傷的風險，但神經(jīng)損傷因素、機制及其與局部麻醉藥的關(guān)系尚未明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與糖尿病代謝紊亂有關(guān)。妊娠期糖尿病母體高血糖狀態(tài)內(nèi)源性活性氧（ROS）生成增加，損傷細胞抗氧化能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在糖尿病病理狀態(tài)下，不同組織（包括神經(jīng)）均可產(chǎn)生ROS，長期過量ROS積累引起慢性氧化應(yīng)激，引起神經(jīng)組織毒副作用。因此本研究在高糖環(huán)境下培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞，建立高糖細胞損傷模型，加入布比卡因，研究ERS細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量與細胞凋亡，探討高糖環(huán)境與布比卡因神經(jīng)毒性作用的關(guān)系。目的在于為解決妊娠期糖尿病局部麻醉藥神經(jīng)毒性防治提供理論依據(jù)，而有關(guān)這方面的研究目前尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM／F12培養(yǎng)基、DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），SHSY-5Y 細胞株（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），酶標儀（Bio-Tek公司，美國），倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本），流式細胞儀（FCM，Becton Dickinson公司，美國），BG-Power600i電泳儀（百晶生物技術(shù)公司，北京），暗匣（粵華醫(yī)療器械廠，汕頭），聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，德國），高速離心機（Eppendorf公司，德國），超凈工作臺（蘇州醫(yī)療器械廠，蘇州）

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) （1）從液氮罐中取出含有細胞的凍存管，立即置于37 ℃水浴中，輕輕搖動，使其盡快融化；（2）從水浴中取出凍存管，用乙醇消毒后打開，用吸管吸出細胞懸液，加入10 mL含15%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液，置于離心管中混合后，1 000r／min離心5min；（3）棄上清，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗1次；（4）用培養(yǎng)液重懸細胞，接種至25cm2培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，以后每2天換液1次；（5）當細胞將要長滿瓶底時，棄培養(yǎng)液，加入少量的胰蛋白酶細胞消化液消化數(shù)分鐘后，在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。當細胞變圓時，立即加入含15%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液中和消化液，用吸管輕輕吹打，吸出細胞，計數(shù)，接種于新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。

1.2.2 細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量變化檢測 將SH-SY5Y 細胞按5×105／孔接種于4個6孔培養(yǎng)板。設(shè)立對照（5.56mmol／L）、陽性（6.10、7.00、7.80、11.10、13.30 mmol／L）、陰 性（僅 加 培 養(yǎng)基）和空白組（反加PBS）。其中兩板培養(yǎng)1d后各孔換各自含糖液繼續(xù)培養(yǎng)1d。其余兩板培養(yǎng)1d后各孔換各自含糖液繼續(xù)培養(yǎng)過夜，再經(jīng)含1 mmol／L 布比卡因培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。消化細胞，EP管收集，1 000r／min離心5min，去上清。按照1∶1 000 用PBS 液稀釋熒光探針DCFH-DA，使其終濃度為10 μL／L。去除細胞培養(yǎng)液，加入適量DCFH-DA 于有培養(yǎng)液的各孔，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，用PBS液洗細胞3次以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。重懸細胞。FCM 檢測細胞內(nèi)熒光強度。

1.2.3 FCM 檢測細胞凋亡 消化SH-SY5Y 細胞，制單細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整濃度至5×105／mL；將細胞接種至兩個24孔培養(yǎng)板，每孔加入500μL。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d。各組細胞更換各自含糖液繼續(xù)培養(yǎng)1d。將其中一板吸凈培養(yǎng)基，用含1 mmol／L 布比卡因培養(yǎng)基培養(yǎng)6h。各組細胞用PBS緩沖液洗滌2次，收集細胞至1.5 mL離心管并用500μL Binding buffer重懸細胞。在每管細胞加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，避光室溫下孵育5min后用FCM 檢測。

1.2.4 Western blot檢測GRP78表達水平 消化SH-SY5Y細胞，制單細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整濃度至5×105／mL；細胞接種至兩個6孔培養(yǎng)板，每孔加入1 000μL。其中一塊培養(yǎng)板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d。各組細胞更換各自含糖液繼續(xù)培養(yǎng)2d。將另一塊培養(yǎng)板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d。各組細胞更換各自含糖液繼續(xù)培養(yǎng)1d。吸凈培養(yǎng)基，每孔加入1mmol／L布比卡因，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6h。然后進行蛋白樣品制備、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、ECL反應(yīng)及曝光、顯影、凝膠圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，ROS水平和細胞凋亡率采用兩因素析因設(shè)計資料方差分析，組間比較采用LSD 法（方差齊）或Dunnett′s T3法（方差不齊）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 布比卡因作用前、后細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量比較 當葡萄糖濃度分別為5.56、6.10、7.00、7.80、11.10、13.30mmol／L 時，布比卡因作用前、后細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量依次為308±12、454±11、526±18、603±45、905±18、653±287 和361±12、478±33、583±68、733±34、984±20、1 571±162。布比卡因作用前、后5.56、7.80、11.10、13.30 mmol／L 組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。6.10、7.00 mmol／L 組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明布比卡因作用前、后隨著葡萄糖濃度升高，ROS產(chǎn)量亦隨之增加。

2.2 布比卡因作用前、后細胞凋亡比較 當葡萄糖濃度分別為5.56、6.10、7.00、7.80、11.10、13.30mmol／L 時，布比卡因作用前、后細胞凋亡率依次為0.014±0.001、0.017±0.001、0.026±0.001、0.029±0.001、0.047±0.001、0.050±0.002和0.018±0.001、0.028±0.001、0.033±0.002、0.043±0.002、0.063±0.001、0.079±0.002。布比卡因作用前、后組內(nèi)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明布比卡因作用前、后隨著葡萄糖濃度升高，細胞凋亡亦隨之增加。

2.3 布比卡因作用前、后細胞GRP78表達量 當葡萄糖濃度分別為5.56、6.10、7.00、7.80、11.10、13.30mmol／L 時，布 比卡因作用前、后細胞GRP78 表達量依次為1.20±0.15、0.88±0.04、0.97±0.05、0.83±0.04、0.94±0.05、0.26±0.06和1.02±0.12、0.97±0.06、0.49±0.04、0.46±0.06、0.22±0.03、0.15±0.07。5.56mmol／L、6.10mmol／L、13.30 mmol／組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。7.00、7.80 mmol／L、11.10 mmol／L組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明低糖環(huán)境可誘導(dǎo)細胞GRP78表達，隨著葡萄糖濃度進一步升高，GRP78表達量劇降；布比卡因作用下，低糖環(huán)境抑制細胞GRP78表達，正常血糖范圍內(nèi)，細胞產(chǎn)生穩(wěn)定量的GRP78較低糖環(huán)境下低。隨著葡萄糖濃度進一步升高，GRP78產(chǎn)量劇降。

3 討 論

高糖環(huán)境下局部麻醉藥神經(jīng)毒性機制的研究報道甚少。妊娠期糖尿病為一類特有糖尿病，不同于原發(fā)性Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。但兩者特點之一為ERS與糖尿病代謝紊亂有關(guān)［2］。

布比卡因作用前、后隨著葡萄糖濃度升高，ROS產(chǎn)量隨之增加，細胞凋亡亦隨之增加。說明SH-SY5Y 細胞在代謝刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有較強的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系，可仍然有很多因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成ERS。能量和營養(yǎng)過剩激發(fā)ERS［3-4］，細胞器代謝負荷過重和線粒體功能障礙產(chǎn)生ROS。高糖環(huán)境激活細胞半胱氨酸酶活性，導(dǎo)致乳酸脫氫酶泄漏，細胞毒性增加［5］。布比卡因使細胞ERS明顯增強，ROS產(chǎn)量增多［6］，細胞毒性增加，細胞凋亡增多。

ERS反應(yīng)是一種細胞水平上的保護性手段。GRP78表達增加提高細胞抵御應(yīng)激的能力。GRP78在正常細胞內(nèi)呈低水平表達［7］，保護細胞免受應(yīng)激因素所導(dǎo)致的凋亡［8］。低糖環(huán)境誘導(dǎo)細胞GRP78表達，隨著葡萄糖濃度進一步升高至正常血糖濃度范圍，GRP78 產(chǎn)量降低；葡萄糖濃度繼續(xù)增高，細胞GRP78表達再次升高。但隨著糖濃度極度增加，ERS增強致氧化，代謝、轉(zhuǎn)化負荷過重，ROS在細胞內(nèi)毒性積累，細胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為GRP78表達降低。細胞ERS增強和（或）自身修復(fù)機制啟動GRP78合成以維持細胞生存，此時表現(xiàn)為GRP78表達呈一定程度增加。ERS后期細胞凋亡增多，GRP78產(chǎn)量急劇下降。本實驗還說明正常血糖濃度是神經(jīng)細胞生長和局部麻醉藥神經(jīng)毒性損傷恢復(fù)所需最適宜環(huán)境［9-15］。

雖然本細胞模型盡量模仿臨床實際情況，但還有許多局限性。人體神經(jīng)細胞所處體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，而在實驗中僅考慮高糖環(huán)境這一獨立因素對SH-SY5Y 細胞的影響。下一步研究方向是在整體動物實驗和臨床受試人群水平研究高血糖環(huán)境對局部麻醉藥神經(jīng)毒性的影響。隨著對ERS與局部麻醉藥神經(jīng)毒性關(guān)系的深入研究，將能更好理解局部麻醉藥神經(jīng)毒性分子機制，為治療局部麻醉藥神經(jīng)毒性提供新的治療靶點和尋找新的治療途徑。

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