丹參脂溶性有效成分丹參酮研究進(jìn)展

李建恒，喬亞君，侯力峰，賀學(xué)禮

(1.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定　071002；2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定　071002)

丹參脂溶性有效成分丹參酮研究進(jìn)展

李建恒1，2，喬亞君1，侯力峰1，賀學(xué)禮2

(1.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定071002；2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002)

摘要：為了獲得高純度、高品質(zhì)的丹參酮，使其更好地發(fā)揮藥理活性，在查閱國(guó)內(nèi)外近10年有關(guān)丹參酮研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)其提取純化、合成制備、藥理作用等研究成果進(jìn)行系統(tǒng)綜述.結(jié)果顯示，應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)手段提取純化得到的丹參酮純度較高、品質(zhì)較好，且易于操作，條件容易控制，其中非離子表面活性劑輔助提取、超臨界CO2萃取、超聲提取、超高壓輔助提取等是應(yīng)用前景較廣的經(jīng)濟(jì)、有效、綠色的提取方法.高效逆流色譜法是效果較好的純化方法.目前丹參酮類物質(zhì)的生物合成技術(shù)也取得了矚目的成就.此外丹參藥理活性的研究主要集中于抗腫瘤、天然抗氧化、抗菌消炎、治療心腦血管疾病等方面，且取得了很好的臨床效果.這些研究為丹參的全面開(kāi)發(fā)利用提供了參考.

關(guān)鍵詞：丹參酮；脂溶性成分；正交設(shè)計(jì)；藥理活性；抗菌

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.019

中圖分類號(hào)：R282

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：志碼：A

文章編號(hào)：編號(hào)：1000-1565(2015)02-0217-08

收稿日期:2014-03-21

基金項(xiàng)目：河北大學(xué)自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(3333112)

Abstract:In order to obtain tanshinone of high purity and high quality,and then research it more systematically,on the basic of reviewing the related literature in recent 10 years,the extraction and purification,synthesis and preparation,content determination and pharmacological effects had been researched and summarized.The result showed that tanshinone had a higher purity and better quality with the application of modern technology,in addition,the extraction method was easy to operate and the conditions was easy to control.Among them,non ionic surfactant assisted extraction,supercritical carbon-dioxide extraction,ultrasonic extraction and ultrahigh pressure assisted extraction were economic,effective,green extraction method and had a widely application prospect.High-speed counter-current chromatography was better purification method.Currently tanshinone’s biosynthesis technology also has made remarkable achievements.Many studies of the strong pharmaceutical activities have focused on anti-tumor,antioxidant,anti-inflammatory and treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases and achieved good clinical results.These studies provided reference for comprehensive development and utilization of Salvia miltiorrhiza in the future.

Researches on tanshinone ofSalviamiltiorrhiza’s

fat-soluble active ingredient

LI Jianheng1,2, QIAO Yajun1, HOU Lifeng1, HE Xueli2

(1. College of Pharmacy， Hebei University，Baoding 071002，China;

2. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China)

第一作者:李建恒(1964-)，男，河北徐水人，河北大學(xué)教授，主要從事天然植物有效成分研究.

E-mail:lijianheng@hbu.edu.cn

Key words：tanshinone;fat-soluble components;orthogonal design;pharmacological activity;antibacterial

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)屬雙子葉唇形科植物，主產(chǎn)于河北、安徽、江蘇、四川等地，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，能夠起到活血通絡(luò)、涼血消癰、祛瘀止痛、清心除煩等作用.自20世紀(jì)30年代以來(lái)，有關(guān)學(xué)者對(duì)丹參的藥用成分和臨床應(yīng)用進(jìn)行了深入研究，并分離得到了許多化學(xué)成分.丹參的化學(xué)成分分為脂溶性和水溶性兩部分，丹參酮(tanshinone,Tsn)是丹參中脂溶性松香烷型二萜類化合物，又稱為總丹參酮，是丹參根部的主要提取物，具有廣泛的藥理作用，受到醫(yī)藥學(xué)家的高度關(guān)注.

總丹參酮按照結(jié)構(gòu)分類為丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、二氫丹參酮I、羥基丹參酮、隱丹參酮、異丹參酮、丹參酮甲酯等藥用成分，它們的相同點(diǎn)是具備鄰醌或?qū)︴Y(jié)構(gòu)，且能夠被還原為二酚類衍生物，氧化后又轉(zhuǎn)化為醌，在此過(guò)程中起到傳遞電子的作用；而且它們的體內(nèi)代謝產(chǎn)物也能夠促進(jìn)或干擾機(jī)體的多種反應(yīng)，所以具有抗癌、抗菌、抗病毒等臨床藥理作用.

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)丹參的研究已經(jīng)突破其化學(xué)成分的性質(zhì)及傳統(tǒng)藥理作用,且丹參酮的臨床應(yīng)用也已經(jīng)非常廣泛，需求量不斷增大.所以目前更多的研究旨在探索如何高效獲取丹參酮并使其發(fā)揮更大的藥理作用，在生態(tài)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)工作者的密切配合和努力下，丹參酮的提取純化、生物合成、藥理作用各個(gè)方面的研究都取得了巨大的成就.

1提取純化

總丹參酮的提取、分離純化工藝雖然發(fā)展較早，但過(guò)去主要以有機(jī)溶劑提取為主，容易導(dǎo)致溶劑殘留量大、環(huán)境污染等問(wèn)題，且提取物純度較低.因此，探尋一種高效的提取純化總丹參酮的方法，對(duì)促進(jìn)丹參酮藥理作用的研究具有很大的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將目前常用的提取方法概括如下.

1.1　提取

1.1.1非離子表面活性劑輔助提取

非離子表面活性劑輔助提取是一種經(jīng)濟(jì)、有效、綠色的提取方法.Bi等[1]根據(jù)目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，選擇0.8 mol/L聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)作為提取的非離子表面活性劑，料液比1∶70(g∶mL)，提取時(shí)間100 min，得到隱丹參酮和丹參酮Ⅰ分別為0.208，0.147 mg/g.然后過(guò)濾提取物并采用濁點(diǎn)萃取濃縮.在pH=5.1，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，平衡溫度65 ℃，平衡時(shí)間10 min條件下，得到表面活性劑中隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的質(zhì)量濃度分別為45.7，40.6 g/mL.此外該方法還可以較好地應(yīng)用于其他含苯環(huán)疏水性化合物的提取.

1.1.2超臨界CO2萃取

劉延上[2]以丹參酮ⅡA為指標(biāo)成分，重點(diǎn)探討了超臨界CO2萃取丹參酮的工藝條件，對(duì)影響萃取效果的各種因素進(jìn)行了全面考察.通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到以體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇浸潤(rùn)40目(粒度420 μm)丹參1 h，在萃取壓力25 MPa、溫度45 ℃、CO2流量25 L/h、萃取時(shí)間3 h，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇作夾帶劑，料液比3∶1(g∶mL)的條件下，丹參酮ⅡA萃取率達(dá)到84.9%，萃取物中丹參酮ⅡA與隱丹參酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.56%.與傳統(tǒng)的醇提工藝相比，該方法耗時(shí)少、提取率高，而且得到的丹參提取物呈紅褐色，品質(zhì)好，其有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)能達(dá)到新藥申報(bào)規(guī)定的要求.本文還應(yīng)用硅膠柱層析技術(shù)對(duì)萃取物中丹參酮ⅡA與隱丹參酮進(jìn)行了分離，選用石油醚-乙酸乙酯作洗脫劑，體積比為7∶2和7∶1，2次洗脫，分離得到了丹參酮ⅡA與隱丹參酮.這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅為丹參酮的工業(yè)化提取和含量測(cè)定提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)，而且為丹參的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用及其產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化提供了理論依據(jù).

1.1.3濕式超微粉碎提取

賀建東等[3]通過(guò)比較靜置提取、回流提取與超微粉碎技術(shù)對(duì)丹參脂溶性成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)超微粉碎提取率最高，因此采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時(shí)間進(jìn)行研究，得到最佳工藝：以體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇作為提取劑，料液比1∶8(g/mL)，提取10 min.其中提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響最為顯著(P<0.05)，乙醇濃度對(duì)提取效果沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，生產(chǎn)中考慮到成本，一般選用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇提取.

1.1.4超聲提取法

賁永光等[4-5]通過(guò)多因素正交實(shí)驗(yàn)對(duì)丹參酮ⅡA的雙頻復(fù)合超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，得到各因素對(duì)丹參酮ⅡA提取率影響次序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)>物料粒徑>固液比>提取時(shí)間>提取溫度，最佳工藝參數(shù)為體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，物料粒徑80~100目(粒度150~178 μm)，料液比1∶20 (g∶mL)，提取時(shí)間35 min，提取溫度55 ℃，在此條件下提取3次，得到丹參酮ⅡA平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89.47%.但是此方法過(guò)分破壞植物細(xì)胞壁，可能導(dǎo)致一些大分子物質(zhì)析出，增加了純化的難度.

1.1.5微波提取法

張力[6]利用微波輔助法提取丹參酮ⅡA，并采用高效液相色譜對(duì)丹參提取物中丹參酮ⅡA進(jìn)行分離測(cè)定，比較了提取劑體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度和時(shí)間、微波功率、液固比等對(duì)產(chǎn)率的影響，得到體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇，料液比1∶9(g∶mL)，微波功率600 W，加熱溫度70 ℃，4 min時(shí)丹參酮ⅡA產(chǎn)率較高.然后提取物經(jīng)D3520型大孔吸附樹(shù)脂純化，丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到53%.實(shí)驗(yàn)還將微波輔助提取工藝與傳統(tǒng)加熱回流提取方法進(jìn)行了比較，得到微波提取工藝可大幅度縮短提取時(shí)間，節(jié)省生產(chǎn)成本，降低能源消耗，同時(shí)可以提高產(chǎn)率，且該方法的優(yōu)越性還體現(xiàn)在符合環(huán)保的要求.

1.1.6超高壓輔助提取

Liu等[7]采用離子液體薄層制備技術(shù)的超高壓輔助提取丹參中5種丹參酮類物質(zhì)，并與熱回流萃取、超聲波提取作了比較，然后通過(guò)顯微鏡觀察超高壓處理之后的丹參根組織.結(jié)果表明：選用0.5 mol/L[C8-MIM][PF6]離子液體的乙醇溶液作為提取劑，壓力300 MPa，提取時(shí)間2 min，料液比1∶20 (g∶mL)，得到二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹參新酮質(zhì)量濃度分別為4.06，9.30，20.3，37.4，0.593 mg/g.經(jīng)HPLC分析采用熱回流法萃取丹參酮的產(chǎn)率較低；超聲波提取雖然產(chǎn)率較高，但是提取時(shí)間長(zhǎng)，綜合考慮超高壓提取技術(shù)用時(shí)短且在室溫下就可以完成，是一種高效的提取方法.掃描電鏡顯微圖顯示經(jīng)高壓處理之后，丹參根組織遭到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞壁破損，這也從根本上解釋了該方法提取率較高的原因.且該方法可以較迅速、均勻地作用于提取材料，又不易引起物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化，是一種值得推廣的高效提取方法.

1.2　純化

1.2.1高速逆流色譜法

Sun等[8]采用高效逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水體積比為6∶4∶6.5∶3.5作為2相溶劑系統(tǒng)對(duì)丹參酮類提取物進(jìn)行分離純化，實(shí)驗(yàn)首先使用乙酸乙酯回流萃取丹參酮類物質(zhì)，然后經(jīng)高效逆流色譜分離，多分子層螺旋柱(上層)作固定相，2相溶劑(下層)作流動(dòng)相，進(jìn)樣量5 mL，分離溫度25 ℃，對(duì)丹參酮類物質(zhì)進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示從400 mg丹參提取物中得到8.2 mg二氫丹參酮I，5.8 mg 1,2,15,16-四氫丹參酮，26.3 mg隱丹參酮，16.2 mg丹參酮I，25.6 mg甘西鼠尾新酮A，68.8 mg丹參酮ⅡA和9.3 mg次甲丹參醌，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97.6%，95.1%，99.0%，99.1%，93.2%，99.3%，98.7%.與屈燚[9]研究結(jié)果一致.表明高效逆流色譜法對(duì)于分離組成復(fù)雜的樣品具有重要意義，尤其適用于天然植物成分的分離.

1.2.2大孔樹(shù)脂法

高媛等[10]選用D101型大孔樹(shù)脂作為純化樹(shù)脂，采用料液比1∶8(g∶mL)，體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇回流提取2次，每次1 h，并探索丹參酮的最佳純化條件如下：樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，吸附速度為3 BV/h，開(kāi)始吸附柱用5 BV水以除去糖類，最后吸附柱用6 BV，體積分?jǐn)?shù)為 90%乙醇，流速為5 BV/ h.結(jié)論：通過(guò)最佳純化條件得到的總丹參酮含量較高，而且技術(shù)簡(jiǎn)單，適合現(xiàn)代生產(chǎn).

2生物合成

隨著研究方法和技術(shù)的不斷提高，丹參中有效成分的分離提取技術(shù)得到快速發(fā)展，但傳統(tǒng)的提取方法所用溶劑量大，提取時(shí)間長(zhǎng)，有效物質(zhì)產(chǎn)率較低；此外丹參酮為熱敏性和光敏性物質(zhì)，提取過(guò)程中易被破壞，所以如果能通過(guò)生物學(xué)以及化學(xué)手段合成丹參酮，對(duì)丹參酮的應(yīng)用將有深遠(yuǎn)意義.

2.1　植物體內(nèi)合成

楊東風(fēng)[11]的研究闡述了丹參酮類在植物體內(nèi)合成途徑分為細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑以及質(zhì)體中的2C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途徑，二者的不同點(diǎn)是制得異戊烯基焦磷酸酯(isopentenyl diphosphate,IPP)的機(jī)理、位置、前體以及產(chǎn)物不同.其中MVA途徑選擇乙酰輔酶A來(lái)做前體合成IPP，進(jìn)而形成甾體、倍半萜和三萜等.限速酶是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)，使甲羥戊酸經(jīng)催化不可逆生成.MEP途徑選用5-磷酸脫氧木酮糖和2C-甲基4-磷酸-4D-赤蘚糖醇來(lái)做前體合成IPP，再經(jīng)縮合形成單萜、二萜和四萜.限速酶是1-去氧木糖-5-磷酸還原酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductoisomerase,DXR)，經(jīng)催化使得1-脫氧-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xyulose5-phosphate,DXP)可逆形成MEP，專一抑制劑是磷甘霉素(fosmidomycin,FOS).且該研究深入探討了總丹參酮的體內(nèi)合成機(jī)制.

2.2　植物體外合成

日前中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心的黃璐琦等[12]采用合成生物學(xué)策略，通過(guò)MVA途徑人工合成丹參酮.該課題組分析了用來(lái)合成次丹參酮二烯的2個(gè)酶(SmCPS和SmKSL)，采用的技術(shù)方法為功能基因組學(xué)技術(shù).同時(shí)，構(gòu)建了合成高產(chǎn)丹參酮前體的酵母工程菌株，然后進(jìn)行一系列生物修飾，使得次丹參酮二烯的產(chǎn)量達(dá)到365 mg/L.在基因表達(dá)、體外酶活性篩選指導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)丹參酮二烯經(jīng)(CYP76AH1)基因催化轉(zhuǎn)化生成鐵銹醇，豐富了異源合成萜類化合物的認(rèn)識(shí)，奠定了丹參酮下游相關(guān)基因發(fā)掘、微生物合成丹參酮的基礎(chǔ).李春苗[13]在實(shí)驗(yàn)室合成了1-氧次丹參酮，該化合物具有很好地抑制癌細(xì)胞的作用.實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)1-氧次丹參酮的全合成進(jìn)行探索，嘗試了3條路線.第1條設(shè)計(jì)路線最關(guān)鍵的步驟是利用[4+2]反應(yīng)構(gòu)建A/B/C 3個(gè)環(huán)系，在嘗試了很多方法后仍未拿到同時(shí)含有A/B/C 3個(gè)環(huán)系的化合物，所以設(shè)計(jì)了第2條路線.該路線中格氏反應(yīng)的中間體不宜分離，且重鉻酸吡啶鎓(pyridinium dichromate,PDC)氧化轉(zhuǎn)位產(chǎn)率較低，故進(jìn)行第3條路線，集第1條和第2條路線優(yōu)點(diǎn)，以簡(jiǎn)單易得的3-甲基-2-丁酮和丙烯酸叔丁酯為原料首先合成含有角甲基的二酮化合物，再進(jìn)行Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)、格氏反應(yīng)、合環(huán)等反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物.該路線的優(yōu)點(diǎn)是在格氏反應(yīng)后用酸處理就可以得到第2條合成路線PDC氧化轉(zhuǎn)位得到的產(chǎn)物，簡(jiǎn)化了合成路線并提高了產(chǎn)率.通過(guò)生物合成技術(shù)得到丹參酮可以避免自然環(huán)境的干擾，生產(chǎn)較規(guī)范，時(shí)間較提取種植的藥材短，質(zhì)量?jī)?yōu)，產(chǎn)量穩(wěn)定，但是距離大規(guī)模的推廣生產(chǎn)仍有一定距離，需要科研工作者的繼續(xù)努力，此外考慮到生產(chǎn)成本等因素，探尋高效簡(jiǎn)單的提取方法仍具有重要意義.相信隨著研究的不斷深入，丹參酮的分離提取以及生產(chǎn)合成技術(shù)必將得到進(jìn)一步完善.

3藥理作用

丹參酮的藥理作用極其廣泛，近些年在抗腫瘤方面的研究不斷深入，取得顯著成果，此外還具有心腦血管藥理作用、天然抗氧化作用及抗菌消炎作用等.

3.1　抗腫瘤作用

近年來(lái)弓建華等[14]研究表明，隱丹參酮對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，不僅能阻礙腫瘤細(xì)胞增殖，而且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞程序性死亡，從而在一定程度上阻礙腫瘤細(xì)胞侵襲和防止其向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移.Li等[15]使用改進(jìn)的MTT法檢測(cè)丹參酮對(duì)K562和Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀評(píng)估了丹參酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力.然后采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這些丹參酮以濃度依賴性和時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞增殖.流式細(xì)胞儀分析表明，這些丹參酮以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)K562凋亡，總的來(lái)說(shuō)，二氫丹參酮、丹參酮I、丹參酮ⅡA和隱丹參酮對(duì)血液惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用.并且大量研究顯示，總丹參酮對(duì)高轉(zhuǎn)移性肺癌PGCL3細(xì)胞以及低轉(zhuǎn)移人肺腺癌PAa細(xì)胞、白血病HL-60和K562細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞株HepG2均有誘導(dǎo)其分化、凋亡的作用，所以丹參酮類有望成為高效低毒的新型抗腫瘤藥物.

3.1.1對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

吳杲等[16]證實(shí)菲醌結(jié)構(gòu)在丹參酮類物質(zhì)中廣泛存在，導(dǎo)致其可以產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，其中DNA分子與菲環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，呋喃環(huán)、醌類結(jié)構(gòu)生成自由基阻礙腫瘤細(xì)胞DNA的合成.尤其是其A環(huán)(芳環(huán))對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，B環(huán)的1,2-鄰萘醌結(jié)構(gòu)也有較高的細(xì)胞毒性.楊麗萍等[17]分別采用不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)Wistar雄性大鼠灌胃處理，得到含藥血清，再用其進(jìn)行胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)，倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察結(jié)果表明，丹參酮ⅡA的含藥血清使胃癌細(xì)胞在增殖過(guò)程中不進(jìn)入或延遲進(jìn)入S期(即DNA合成期)，停止于G0-G1期，阻礙DNA合成.

3.1.2對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用

丹參酮具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用.郭慶寅等[18]研究了丹參酮ⅡA與全反式維甲酸(all-trans retinoid acid,ATRa)及三氧化二砷(As2O3)誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型和對(duì)PML-RARα融合基因及其蛋白影響的比較.結(jié)果表明,丹參酮ⅡA能抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)分化，使NB4細(xì)胞PML蛋白異常分布重新定位、NBs結(jié)構(gòu)恢復(fù)、PML-RARα融合蛋白降解.

3.1.3對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

在基因調(diào)控下細(xì)胞程序化死亡(programmed cell death)的過(guò)程稱為細(xì)胞凋亡(apoptosis)，即在特定生理病理情況下，維持穩(wěn)定的正常細(xì)胞增殖、分化以及凋亡情況，但是癌細(xì)胞無(wú)限制增殖、分化受阻；誘導(dǎo)凋亡.隱丹參酮通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡顯示了顯著的抗腫瘤作用[19].Chiu等[20]研究表明通過(guò)MTT分析測(cè)定丹參酮ⅡA在A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)、鈣和A549細(xì)胞釋放的活性氧(ROS)的影響.Western印跡法檢測(cè)p53，Bax，Bcl-2和β-肌動(dòng)蛋白在A549細(xì)胞中的蛋白表達(dá).丹參酮ⅡA對(duì)計(jì)量和時(shí)間的依賴方式明顯地抑制了A549細(xì)胞的增殖率.流式細(xì)胞儀的結(jié)果表明，當(dāng)A549細(xì)胞培養(yǎng)在不同質(zhì)量濃度的丹參酮中(對(duì)照組，2.5，5和10 g/L)48 h，亞G1期細(xì)胞增加.丹參酮ⅡA誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生、鈣離子和MMP的下降.Western印跡結(jié)果表明，在丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度為5 μg/mL中培養(yǎng)6，12和24 h后， p53和Bax蛋白表達(dá)增加，但原癌基因bcl-2顯著下降.丹參酮ⅡA抑制了肺癌A549細(xì)胞的增殖，可能通過(guò)降低MMP或者Bax/Bcl-2感應(yīng)率的升高誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

3.2　對(duì)心腦血管的影響

3.2.1抗動(dòng)脈粥樣硬化作用

易成[21]建立家兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，比較正常組、AS組及丹參酮ⅡA組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的變化，比較各組血清脂質(zhì)水平、斑塊面積，免疫組化分析Bcl-2，Bax及MCP-1在粥樣硬化斑塊中的表達(dá).結(jié)果：丹參酮ⅡA組血清TG水平和斑塊面積比例低于AS組(P<0.01)；免疫組化顯示AS組Bcl-2，Bax及MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)與丹參酮ⅡA組有顯著性差異(P<0.05).結(jié)論：丹參酮可抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成.Gao等[22]采用新興的實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，丹參酮能夠防止動(dòng)脈粥樣硬化和心肌損傷肥大.對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化，丹參酮ⅡA能夠抑制低密度脂蛋白氧化，使單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，以及巨噬細(xì)胞中膽固醇的積累、促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和血小板聚集.丹參酮ⅡA具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊活性的潛能，其心臟保護(hù)作用主要與抗氧化和抗炎作用有關(guān).

3.2.2抗心肌缺血缺氧

丹參酮ⅡA已被證實(shí)在心肌梗死(MI)后能夠抑制miR-1，同時(shí)減少心律失常.Zhang等[23]研究證明，在結(jié)扎乳鼠左前降支前(LAD)，將丹參酮ⅡA平均每天給藥，結(jié)扎之后，再持續(xù)給藥3個(gè)月，并將其心肌細(xì)胞持續(xù)24 h暴露在O2與N2的混合氣體條件下，來(lái)模擬體內(nèi)缺血細(xì)胞.用Western Blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)通過(guò)PCR定量評(píng)價(jià) miR-1的水平.結(jié)果表明，丹參酮ⅡA能夠通過(guò)改善心臟功能解除缺血損傷.此外，在缺血缺氧的心肌細(xì)胞中，丹參酮ⅡA能夠抑制活化的p38 MAPK和心臟的特殊轉(zhuǎn)錄因子SRF與Mef2.預(yù)處理的p38 MAPK抑制劑SB203580(10 μm)，顯著緩解缺氧誘導(dǎo)miR-1的增量，并恢復(fù)其下游Cx43蛋白的表達(dá).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，丹參酮ⅡA發(fā)揮作用保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血缺氧損傷.這種作用是通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路抑制miR-1的表達(dá).這可能為缺血性心肌保護(hù)提供了新的目標(biāo).

3.2.3改善微循環(huán)，增加血流量

隱丹參酮能夠改善微循環(huán)，增加血流量.Francis等[24]研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮對(duì)大鼠的冠狀動(dòng)脈有舒張作用，在血管平滑肌細(xì)胞中Ca2+內(nèi)流被抑制，并且在介導(dǎo)此作用中發(fā)揮了最為關(guān)鍵的作用，質(zhì)量濃度為30 μg/mL的隱丹參酮拮抗由Ca2+誘導(dǎo)的血管收縮可達(dá)59%，從而改善血液流變學(xué).

3.2.4對(duì)腦血管的影響

VEGF及其受體(VEGFR)系統(tǒng)在發(fā)生腦缺血后可被低氧激活，來(lái)加強(qiáng)血管增生和新生血管的形成，促進(jìn)受累組織供氧量及血流灌注，降低神經(jīng)元凋亡率，進(jìn)而緩解腦損傷程度.缺血與再灌注間大腦皮層內(nèi)激素-1基因的表達(dá)被丹參酮部分抑制，這也許是在大腦局部缺血與再灌注之間形成一個(gè)保護(hù)機(jī)制.張文建等[25]通過(guò)培養(yǎng)純化的主要人類大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMVEC)建立了BBB 模型來(lái)研究丹參酮ⅡA對(duì)人體血腦屏障 (BBB)的白細(xì)胞相關(guān)缺氧復(fù)氧損傷的體外影響.結(jié)果顯示，BBB 模型對(duì)HRP下丘腦調(diào)節(jié)性多肽比融合性的HUVECs有較高的TEER 和較低的滲透性.對(duì)于HRP BBB的滲透性通過(guò)缺氧復(fù)氧被加強(qiáng)，同時(shí)在復(fù)氧前增加活化白細(xì)胞上清液也能增強(qiáng).但是在缺氧前添加丹參酮ⅡA后這樣的影響被顛倒.而且，丹參酮ⅡA能夠降低血清MMP-9，TNF-α，IL-1α，IL-2，IFN-γ和白細(xì)胞活性氧水平.總之丹參酮ⅡA通過(guò)減弱白細(xì)胞活化和抑制白細(xì)胞產(chǎn)品的損傷能夠保護(hù)BBB免受白細(xì)胞相關(guān)缺氧復(fù)氧損傷.因此丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注損傷可能是一種新的治療劑.

3.3　抗氧化作用

王昕[26]發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能夠有效抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物與 DNA 的相互作用.通過(guò)消除脂類自由基從而阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)保護(hù)DNA，對(duì)DNA加成物的生成有抑制作用，進(jìn)而降低其細(xì)胞毒性.心肌線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化途徑中生成的脂類自由基，可以被丹參酮有效消除，保護(hù)了線粒體的呼吸作用.

3.4　抗菌作用

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌能夠被隱丹參酮、羥基丹參酮、丹參酸甲酯、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡB5種丹參酮類成分顯著抑制.強(qiáng)喆等[27-28]選用大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌等幾種常見(jiàn)致病菌作為實(shí)驗(yàn)用菌種，測(cè)定總丹參酮包合物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株的抑制效果，并采用杯碟法測(cè)定體外抑菌活性，瓊脂稀釋法測(cè)定最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC).結(jié)果表明，總丹參酮包合物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株均有不同程度的抑制效果，其中金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和停乳鏈球菌的抑制效果顯著，此外實(shí)驗(yàn)將丹參總脂溶性成分的提取物制備成包合物水溶液，更大程度上發(fā)揮了丹參酮的抑菌活性，為丹參抗菌制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

3.5　抗炎作用

唐濤等[29]選用在小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞系RAW264.7刺激靶細(xì)胞，采用不同劑量的丹參酮ⅡA刺激RAW264.7細(xì)胞系，于24，48 h后，采用MTT比色和半定量RT-PCR測(cè)定經(jīng)過(guò)刺激處理后的細(xì)胞.結(jié)果顯示，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞的增殖明顯受到丹參酮ⅡA的抑制，半抑制濃度(IC50)為43.2 μmol/L；半定量RT-PCR檢測(cè)表明，磷脂酶A2受到丹參酮ⅡA的抑制，進(jìn)而緩解炎癥.同時(shí)隱丹參酮也具有抗炎作用.Jiang等[30]研究指出PF2401-SF(丹參標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量分?jǐn)?shù))：丹參酮Ⅰ(11.5%)，丹參酮ⅡA(41.0%)，和隱丹參酮(19.1%)在體內(nèi)和體外均具有潛在的抗炎作用，并證實(shí)PF2401-SF在RAW264.7細(xì)胞中對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的一氧化氮(NO)產(chǎn)生及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)顯示出消炎效力.此外，還評(píng)估PF2401-SF能顯著降低右旋糖酐誘導(dǎo)的大鼠急性關(guān)節(jié)炎的炎癥.

4小結(jié)與展望

從藥用植物中篩選藥物是新藥開(kāi)發(fā)的主要手段之一.丹參酮是丹參的有效成分之一，除具有傳統(tǒng)的活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、養(yǎng)心安神功效外，近年來(lái)對(duì)其抗氧化、抗菌、抗炎、治療心腦血管疾病、抗腫瘤等藥理作用的研究日趨深入，使其擁有非常廣闊的應(yīng)用前景.

目前，中藥藥材長(zhǎng)期粗放式種植導(dǎo)致產(chǎn)量和化學(xué)成分逐年下降，質(zhì)量得不到保證，因此要保證丹參酮的產(chǎn)量須全面考察不同種植條件對(duì)丹參藥用成分含量及品質(zhì)的影響，普及中藥現(xiàn)代化種植，并且加強(qiáng)對(duì)丹參提取純化，合成制備技術(shù)的研發(fā)，以期更好地利用丹參的藥理作用，建立丹參酮的系統(tǒng)研究.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)