microRNA-199a/b-3p 對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響①

王子航 李春實(shí) 康勁松 米旭光 劉 磊 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延邊 133002)

近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度已高出原高發(fā)國(guó)家1～2 個(gè)百分點(diǎn)，且呈明顯的年輕化趨勢(shì)，每年有16.9 萬(wàn)婦女患乳腺癌，且發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位［1］。轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致乳腺癌病人死亡的首要原因，轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生就極少治愈且預(yù)后不佳。晚期乳腺癌患者的平均生存時(shí)間只有18～30 個(gè)月［2，3］。同時(shí)，轉(zhuǎn)移常伴隨著對(duì)傳統(tǒng)及實(shí)驗(yàn)性治療方法的耐受性［4］。現(xiàn)有的治療靶點(diǎn)和治療藥物對(duì)于組織學(xué)形態(tài)多種多樣、高度異質(zhì)性的乳腺癌仍顯不足，因此，尋找抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的新治療靶點(diǎn)、新治療手段是研究的重點(diǎn)，將極大改善患者的預(yù)后，提高總生存率。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞，人胚腎HEK293T 細(xì)胞使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中國(guó))的DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素(100 kU/L)、鏈霉素(100 μg/ml)，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑耗材 Transwell 小室(Corning，美國(guó))、基質(zhì)膠(Sigma，美國(guó))、microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中國(guó))、D-luciferin(上?？泼羯锟萍加邢薰荆袊?guó))、PVDF 膜(Millipore，德國(guó))、鼠抗PAK4 和HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗(CST，美國(guó))、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4 干擾載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、其他常規(guī)試劑(北京化工，中國(guó))。

1.3 免疫印跡分析 提取細(xì)胞總蛋白后，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜，TBST 配制的脫脂奶粉封閉液封閉24 h，標(biāo)記鼠抗PAK4 一抗(1∶1 000)室溫1.5 h，TBST 清洗3 次，標(biāo)記HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶1 000)，TBST 清洗3 次，ECL 顯影。

1.4 遷移能力和細(xì)胞膜皺起動(dòng)態(tài)分析的檢測(cè) 在6 孔板中接種1 ×106個(gè)MDA-MB-231 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 貼壁后，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，24 h 后，記錄12 min 總細(xì)胞面積變化，依照文獻(xiàn)方法計(jì)算細(xì)胞膜皺起動(dòng)態(tài)變化［5］;劃線，拍照。繼續(xù)培養(yǎng)，在24 h、48 h 時(shí)拍照，Image J 軟件分析遷移能力。

1.5 侵襲能力的檢測(cè) 用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，饑餓24 h，然后調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105ml-1，將200 μl 細(xì)胞懸液接種于Transwell(Transwell小室內(nèi)預(yù)鋪Matrigel 膠)小室的上室內(nèi);在24 孔板中加入600 μl 含有20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，然后將Transwell 小室放入24 孔板中;37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h;取出Transwell 小室，用0.01 mol/L 的PBS 輕柔沖洗，然后用棉簽輕柔擦除上室內(nèi)粘附的細(xì)胞，在95%的乙醇中固定，最后采用結(jié)晶紫染色;在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野(×200)，觀察穿透小室的細(xì)胞數(shù)量，取其平均值，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得計(jì)量資料以±s 表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌細(xì)胞中內(nèi)源PAK4表達(dá) 在乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中，miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染組內(nèi)源PAK4 蛋白表達(dá)被顯著抑制(圖1)。

2.2 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲和細(xì)胞膜皺起 miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞細(xì)胞遷移率分別為0.24 和0.46，與對(duì)照0.6 和0.92 相比顯著降低(圖2A)，P ＜0.05;miR-199a/b-3p mimcs 轉(zhuǎn)染48 h 后，乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲率為0.21(圖2B)和平均細(xì)胞膜皺起面積為2.4 μm2×103(圖2C)均顯著下降，P ＜0.05。

2.3 干擾PAK4 表達(dá)抑制MDA-MB-231 細(xì)胞遷移侵襲和細(xì)胞膜皺起 在乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PAK4 Si 24 h 后，檢測(cè)PAK4 蛋白表達(dá)，與對(duì)照相比PAK4 蛋白表達(dá)量顯著降低(圖3A);抑制PAK4 表達(dá)24 h、48 h 后的MDA-MB-231 細(xì)胞細(xì)胞遷移率為0.3和0.7，與對(duì)照0.54和0.96(圖3B)相比均顯著下降，P ＜0.05;而抑制PAK4 表達(dá)48 h后，MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲率0.51(圖3C)和平均細(xì)胞膜皺起面積2.13 μm2×103(圖3D)均顯著下降，P ＜0.05。

圖1 miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)源PAK4 蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of PAK4 inhibited by miR-199a/b-3p

圖2 miR-199a/b-3p 抑制MDA-MB-231 遷移(A)，侵襲(B)和平均細(xì)胞膜皺起面積(C)Fig.2 Migration index (A)，invasion index (B)and average protrusive area (C)of MDA-MB-231 inhibited by miR-199a/b-3p

圖3 MDA-MB-231 細(xì)胞中PAK4 表達(dá)量(A)，干擾PAK4 抑制遷移(B)，侵襲(C)和平均細(xì)胞膜皺起面積(D)Fig.3 Expression (A)，migration (B)，invasion (C)and average protrusive area (D)of PAK4 in MDA-MB-231 cellstransfected PAK4i

3 討論

自1991 年至2010 年間，乳腺癌死亡率增長(zhǎng)了32.89%，成為死亡率增長(zhǎng)最快的癌癥，其發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位［6］。我國(guó)城市中乳腺癌死亡率增長(zhǎng)了38.91%，已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病［7］?，F(xiàn)在乳腺癌的治療藥物以蒽環(huán)類(lèi)、諾維本、紫杉類(lèi)和健擇為主導(dǎo)，偏晚期乳腺癌惡性度高，應(yīng)用化療藥物治療則敏感率低副作用大，且預(yù)后差，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［8］。microRNA(miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度約為20～25 個(gè)核苷酸的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的非編碼單鏈的小分子RNA［9］，并且microRNA 可通過(guò)胞外體、微囊泡等形式由細(xì)胞主動(dòng)分泌至血液中，被受體細(xì)胞所攝取，從而調(diào)控受體細(xì)胞的功能，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10，11］。因此，miRNA 在腫瘤診斷、腫瘤分型、預(yù)后判斷及基因治療的作用越來(lái)越受到關(guān)注。

有研究顯示miR-199a/b-3p 在多種腫瘤細(xì)胞中明顯低表達(dá)，上調(diào)miR-199a/b-3p 可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［12，13］。由前期工作得知，miR-199a/b-3p在乳腺癌組織樣本的表達(dá)水平與癌旁正常組織相比顯著下調(diào)。這提示miR-199a/b-3p 可能在乳腺癌的存活發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其是否抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移未見(jiàn)研究。因此，本研究擬探究miR-199a/b-3p對(duì)于乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。在乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中超表達(dá)miR-199a/b-3p 后，細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯下降，說(shuō)明miR-199a/b-3p具有抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。膜皺起檢測(cè)發(fā)現(xiàn)超表達(dá)miR-199a/b-3p 后，MDA-MB-231 平均膜皺起面積顯著減少，提示miR-199a/b-3p 可抑制乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。并且，miR-199a/b-3p 可以下調(diào)內(nèi)源PAK4 蛋白的表達(dá)量，因此我們推測(cè)其抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲和膜皺起可能是通過(guò)下調(diào)PAK4 實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)干涉內(nèi)源的PAK4 表達(dá)，MDA-MB-231 細(xì)胞遷移侵襲能力明顯減弱，平均膜皺起面積減少，說(shuō)明miR-199a/b-3p 抑制乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力至少部分是通過(guò)靶向抑制PAK4 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

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