大鼠皮膚移植急性排斥模型中脾臟Toll 樣受體的表達特點①

張 維 許鵬祥 錢世鹍 (廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科，廣州 510260)

Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族是病原相關模式識別受體，在協(xié)調先天性免疫應答和適應性免疫應答中均起到重要調節(jié)作用［1］。Toll 樣受體在免疫細胞中廣泛表達，包括單核細胞、樹突狀細胞、B 細胞和T 細胞等細胞的表面，在移植過程中可以通過與外源性配體(如入侵的病原體)或者細胞損傷釋放自身內源性配體結合的方式而被激活［2-5］。Toll 樣受體信號在移植生物學中發(fā)揮多方面作用，如排斥反應、免疫耐受、缺血/再灌注損傷(IRI)和移植后感染［6-9］。我們通過建立大鼠皮膚移植急性排斥反應模型，并與正常大鼠生理穩(wěn)態(tài)相比較，檢測Toll 受體在外周免疫器官脾臟中單個核細胞的mRNA 和脾臟組織中Toll受體蛋白的表達水平和特點，探討Toll 受體表達與器官移植急性排斥反應的關系，尋找臨床診療的潛在途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級別Sprague-Dawley(SD)大鼠，Wistar 大鼠，均為8 周齡雄性大鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 主要儀器與試劑 大鼠Toll 受體mRNA 檢測試劑盒、Trizol 購于日本TaKaRa 公司;Nycodenz 粉劑購于挪威Axis-shield 公司，按說明用PBS 液配成14.5%濃度梯度離心液;使用Primer Premier 5.0 軟件設計合成引物(表1:大鼠Toll 受體合成引物序列)，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成;大鼠Toll 受體蛋白檢測抗體購于武漢博士德生物工程有限公司;實時定量熒光Roche 480 PCR 儀(美國Roche 公司);自動石蠟標本包埋機(江蘇常州中威電子儀器有限公司，BMJ-Ⅲ型);病理組織切片機(德國Leica 公司，Leica2235 型);光學顯微鏡(日本NIKON ECLIPSE 55i 型)。

1.3 實驗分組及建立模型 隨機分為4 組，A 組為同種異基因組，B 組為同種同基因組，C 組為假手術組，D 組為正常對照組，每組6 只。A 組供體為Wistar 大鼠，SD 大鼠作為受體，B 組供體為SD 大鼠，受體為另一只SD 大鼠，C 組為SD 大鼠自體皮膚移植原位縫合，各組大鼠均未作特殊處理。取供體大鼠背部中間偏上區(qū)剪取郵票大小的全厚背部皮膚移植到受體制備移植組模型。

1.4 標本的獲取及檢測 手術后大鼠全部存活，分別在術后第1、4、7、10、14、21 天時間點取各組大鼠1 只，脫臼處死大鼠后，無菌操作取出脾臟，留取小部分脾臟用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片后用于免疫組化檢測組織Toll 受體蛋白表達，顯微鏡下觀察圖片呈淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆分別表示弱陽性(+)、中等陽性(++)和強陽性(+++);另大部分脾臟用14.5%Nycodenz-PBS 密度梯度離心液提取出單個核細胞，再用Trizol 一步法提取RNA 行實時熒光定量檢測其Toll 受體mRNA 表達。所有實驗均重復3 次。

1.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)用±s 表述，組間比較采用單因素方差分析，采用S-N-K 法進行多重比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠移植皮片存活情況 A 組大鼠移植皮片在術后3～4 d 左右開始出現(xiàn)脫水、干燥，皮膚質地變硬，7 d 后移植皮片出現(xiàn)邊緣翹起，部分區(qū)域變黑，10 天時出現(xiàn)移植皮片變黑、變硬，面積稍縮小，14 d 時出現(xiàn)皮片面積縮小約60%，在第21 天時移植皮片表皮層從真皮層分離、脫落。B 組大鼠移植皮片在術后4 d 時色澤紅潤，彈性好，柔軟，7～8 d 時邊緣稍干燥，14 d 時皮片基本愈合，21 d 皮片少許毛發(fā)生長。C 組大鼠移植皮片術后第7 天紅潤、柔軟，第14 天時移植皮片愈合，并出現(xiàn)少部分毛發(fā)，21 d 時移植皮片與周圍色澤一致，毛發(fā)基本長滿。A 組大鼠移植皮片出現(xiàn)嚴重的排斥反應，B 組移植皮片呈免疫耐受狀態(tài)，C 組皮片術后愈合良好，綜上所述，各組大鼠移植皮片排斥反應程度與Toll 受體的表達檢測情況趨勢上基本一致。

2.2 實時熒光定量檢測大鼠脾臟單個核細胞Toll受體mRNA 表達 與正常大鼠為參數(shù)的D 組比較，21 d 實驗觀察期內各實驗模型組(A 組、B 組、C 組)TLR4、TLR9、TLR10 的mRNA 實時熒光定量檢測水平變化顯示一定趨勢性;A 組整體水平升高，而B組、C 組整體水平降低;A 組與B 組、C 組比較，TLR4、TLR9、TLR10 mRNA 表達的水平均存在明顯差異(P＜0.05)，B 組與C 組之間無差異(P ＞0.05)。提示A 組中TLR4、9、10 三者mRNA 在術后脾臟中表達呈現(xiàn)整體升高趨勢，而TLR4 的相對表達水平顯得更為靈敏，TLR9、10 的升高則比較平穩(wěn)。

表1 大鼠Toll 受體合成引物序列Tab.1 Primer sequence of rat Toll like receptor

TLR4 及TLR9 mRNA 水平變化存在趨向一致的時相特點，A 組中TLR4、TLR9 mRNA 都于術后第1 天開始上升;TLR4 mRNA 于第7 天稍有回落，而TLR9 mRNA 于第10 天稍有回落;之后二者再次升高，并于第21 天達峰值。而B 及C 組均于術后第1天下降，B 組在第7 天達最低值，C 組在第4 天達最低值，在第10 天重新出現(xiàn)上升并于第21 天回落到低值。A 組中TLR10 mRNA 的表達水平在移植術后第1 天升高不明顯，在第4 天繼續(xù)升高，之后逐漸平穩(wěn)升高，在第21 天達峰值(表2～4:大鼠脾臟單個核細胞TLR4、9、10 mRNA 的表達;圖1～3:大鼠脾臟單個核細胞TLR4、9、10 mRNA 的表達)。

表2 大鼠脾臟單個核細胞TLR4 mRNA 的表達Tab.2 Expression of TLR4 mRNA in spleen mononuclear cell

表3 大鼠脾臟單個核細胞TLR9 mRNA 的表達Tab.3 Expression of TLR9 mRNA in rat spleen mononuclear cell

表4 大鼠脾臟單個核細胞TLR10 mRNA 的表達Tab.4 Expression of TLR10 mRNA in rat spleen mononuclear cell

圖1 大鼠脾臟單個核細胞TLR4 mRNA 的表達Fig.1 TLR4 mRNA expression in rat spleen mono-nuclear cell

圖2 大鼠脾臟單個核細胞TLR9 mRNA 的表達Fig.2 TLR9 mRNA expression in rat spleen mononuclear cell

2.3 免疫組化檢測大鼠脾臟組織Toll 受體蛋白的表達 A 組中TLR4、9、10 三者的蛋白表達水平均明顯強于B、C、D 組;后三者之間表達水平基本相同，呈現(xiàn)淡黃色顆粒(+)。A 組中TLR4、9、10 的蛋白表達水平在術后第1 天至第14 天呈現(xiàn)棕黃色顆粒(++)，第21 天呈現(xiàn)褐黃色粗顆粒(+++)。A組Toll 受體蛋白水平的升高與其mRNA 的表達水平相比升高趨勢基本一致(圖4～6:免疫組化檢測移植大鼠脾臟組織TLR4、9、10 蛋白表達;圖7:免疫組化檢測正常大鼠TLR4、9、10 蛋白表達)。

圖3 大鼠脾臟單個核細胞TLR10 mRNA 的表達Fig.3 TLR10 mRNA expression in rat spleen mononuclear cell

圖4 免疫組化檢測移植大鼠脾臟TLR4 蛋白表達(×400)Fig.4 Immuno-histochemistry was adopted to test transplanted rat's spleen TLR4 protein expression(×400)

圖5 免疫組化檢測移植大鼠脾臟TLR9 蛋白表達(×400)Fig.5 Immuno-histochemistry was adopted to test transplanted rat's spleen TLR9 protein expression(×400)

圖6 免疫組化檢測移植大鼠脾臟TLR10 蛋白表達(×400)Fig.6 Immuno-histochemistry was adopted to test transplanted rat's spleen TLR10 protein expression(×400)

圖7 免疫組化檢測正常大鼠脾臟TLR4、9、10 蛋白表達(×400)Fig.7 Immuno-histochemistry was adopted to test normal rat's spleen TLR4，9 and 10 protein expression(×400)

3 討論

Toll 樣受體是存在于機體內的一類重要的模式識別受體，可識別病原體表達的病原相關分子模式(PAMPs)并與其結合，使Toll 樣受體通過髓樣分化因子88(MYD88)途徑啟動信號通路，誘導NF-κB活化，從而使抗原提呈細胞(APCs)開始成熟，并持續(xù)增加共刺激分子和其他促炎癥細胞因子的釋放，激活初始T 細胞來啟動免疫應答［10，11］。這種信號通路途徑在Th1 細胞針對微生物抗原的免疫應答中起到關鍵作用［12］，因此TLR 信號通路使免疫系統(tǒng)能夠識別體內入侵的病原體和調控適應性免疫應答［13］，這些發(fā)現(xiàn)與哺乳動物免疫系統(tǒng)防御入侵的病原體相一致［14］。故對Toll 樣受體的研究有助于闡明免疫系統(tǒng)與急性排斥反應的本質，越來越多的研究也證實其在移植免疫和免疫系統(tǒng)失衡的治療中提供新的思路。

采用Wistar 大鼠為供體、SD 大鼠為受體的同種異體皮膚移植可作為建立急性排斥反應模型之一，能在術后引起急性排斥反應發(fā)生。本研究通過Wistar 和SD 大鼠建立皮膚移植模型，檢測Toll 樣受體的表達情況。利用RT-PCR 和免疫組化對大鼠外周免疫器官脾臟單個核細胞中TLR4、9、10 的檢測結果均表明mRNA 和蛋白表達水平增加;說明TLR4、TLR9、TLR10 都參與了排斥反應;并且各自表達時間先后上還存在一定差異性，我們推測其參與排斥反應的先后可能不同。目前該方面研究大部分是針對移植效應器官進行單個或者兩個TLR 樣受體研究，本研究以外周免疫調節(jié)器官脾臟為目標，對脾臟中的TLR4、9、10 的表達情況進行同步研究，這些對于闡明TLR 在脾臟中參與移植排斥的免疫調節(jié)，以及協(xié)同機制可能會有較好的幫助。

急性移植排斥反應是器官移植術后主要的并發(fā)癥，是一系列免疫分子參與的復雜免疫過程。一些研究表明TLR4 能被內源性配體如熱休克蛋白、硫酸類肝素、表面活性物質等激活，并有研究證實在移植排斥反應中這些配體的表達增加了，可能的機制為通過配體激活TLR4，使TLR4 通過髓樣分化因子88(MYD88)途徑啟動信號通路來參與移植排斥反應［15-20］。TLR9、10 在急性排斥反應中的研究較少，兩者在移植排斥反應中的作用不太清楚。本研究結果發(fā)現(xiàn)TLR4、9、10 在A 組大鼠外周免疫器官脾臟中表達水平升高，提示TLR4、9、10 均參與急性排斥反應，但是否促進移植免疫排斥反應尚難確定;同時TLR4、9、10 在表達時相上存在一定差異性。另外，雖然無急性排斥的同基因移植組(B 組)與假手術組(C 組)數(shù)據(jù)比較無統(tǒng)計學差異，但其TLR4、9、10mRNA 表達水平隨時間變化存在一定波動性。因此，我們認為需進一步探索的機制是:TLR4、9、10 參與急性排斥反應過程中是否存在序貫性特點;并且除MYD88 信號通路之外是否還存在其他信號通路。脾臟是淋巴細胞遷移和接受抗原刺激后發(fā)生免疫應答、產生免疫效應分子的重要場所，如果能分選其中抗原遞呈功能最強大的樹突狀細胞來檢測Toll樣受體的表達則可以更好地闡釋兩者在移植免疫中的作用。

綜上所述，我們認為TLR4、9、10 可以在器官移植排斥反應中被激活，導致適應性免疫應答的發(fā)生，探索移植術后抑制Toll 樣受體的激活可能為防治急性排斥反應的發(fā)生提供新的治療靶點。

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