雞蛋白提取液誘導(dǎo)細(xì)胞后干細(xì)胞蛋白芯片分析①

阮光萍 姚 翔 劉菊芬 王金祥 李自安 胡媛媛 潘興華

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，昆明 650032)

發(fā)現(xiàn)一種提取液能促進(jìn)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變將在再生醫(yī)學(xué)研究中有重要的意義。有文獻(xiàn)報道動物的卵細(xì)胞提取液能重新編程體細(xì)胞，包括豬的卵細(xì)胞［1］和非洲爪蟾的卵細(xì)胞［2，3］提取液都能使體細(xì)胞核重編程。在這個研究中，我們用雞蛋白提取液作用于不同細(xì)胞，共培養(yǎng)3 d 后，收集細(xì)胞，送公司做干細(xì)胞蛋白芯片檢測，現(xiàn)將研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 4 種細(xì)胞為我們實驗室經(jīng)常培養(yǎng)的細(xì)胞，C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(C57-BMSC)(自己制備)，樹鼩的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(TS-UCMSC)(自己制備)，293T 細(xì)胞(購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)和GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染成功的293T 細(xì)胞(293T-GFP)(自己轉(zhuǎn)染成功)。

1.2 雞卵清提取液的制備 取幾個雞卵，無菌分離卵清和卵黃，卵清按1∶1 加裂解液，充分?jǐn)噭颍娣庞?20℃。凍融3 次后，離心，取上清，4℃保存。裂解液配方:50 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L HEPES，pH8.2，1 mmol/L 二 硫 蘇 糖 醇(DTT)，0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液用50%的終濃度與293T 細(xì)胞共培養(yǎng)3 d，然后用定量PCR 的方法檢測細(xì)胞多能基因OCT4和NANOG 與對照(培養(yǎng)基培養(yǎng))相比明顯升高，即為質(zhì)控指標(biāo)合格，可用于下面的實驗。

1.3 干細(xì)胞蛋白芯片檢測步驟 每個芯片孔中加入100 μl 的1 ×封閉液，室溫?fù)u床上孵育30 min，避免產(chǎn)生氣泡;抽去封閉液，每個孔中添加100 μl 樣品，一個陣列一個樣品;4 ℃振蕩過夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機(jī)清洗玻片，每孔加入70 μl 生物素標(biāo)記抗體;室溫震蕩孵育1～2 h，清洗，每孔加入70 μl 的1 500 倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育1～2 h。清洗，采用激光掃描儀例如Axon GenePix 掃描信號。采用芯片分析軟件提取數(shù)據(jù)，對于Fold change，選取大于1.5 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 Western blot 檢測多能標(biāo)志蛋白OCT4 和NANOG 兔抗人OCT4 多克隆抗體購自Immunoaway 公司，鼠抗人NANOG 單克隆抗體購自Millipore公司，二抗均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。293T細(xì)胞在6 孔板中，一孔加培養(yǎng)基，一孔加50%終濃度的雞蛋白提取液，共培養(yǎng)3 d 后，用碧云天的IP細(xì)胞裂解液提細(xì)胞蛋白，取50 μl 細(xì)胞蛋白液加10 μl 6 ×的上樣緩沖液，100℃水浴5 min，上樣20 μl，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后，100 v 電壓轉(zhuǎn)膜1 h，膜用5%脫脂奶粉的TBS 封閉37℃1 h，將一抗1∶250 稀釋于2%脫脂奶粉的TBS 中，37℃振搖1 h，TTBS 洗3 次，每次5 min，二抗1∶200 稀釋于2%脫脂奶粉的TBS 中，37℃振搖1 h，TTBS 洗3 次，每次5 min，ECL 顯色，用Tanon 的化學(xué)發(fā)光成像儀檢測發(fā)光條帶。

2 結(jié)果

2.1 C57-BMSC 有3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 SOX17、BMPR-1A 和NANOG 是干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，當(dāng)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變后細(xì)胞中這幾個蛋白的表達(dá)升高，我們用50%終濃度的雞蛋白提取液與C57-BMSC 共培養(yǎng)3 d 后，這幾個蛋白的表達(dá)明顯升高，說明C57-BMSC 又向更多能的干細(xì)胞分化了，見圖1。

2.2 TS-UC-MSC 有1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 BMPR-1A 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，TS-UCMSC 用50%雞蛋白提取液共培養(yǎng)3 d 后，與未加雞蛋白提取液培養(yǎng)的細(xì)胞相比，BMPR-1A 明顯升高，說明細(xì)胞又向多能干細(xì)胞的方向分化了，見圖2。

2.3 293T 有1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 BMPR-1A 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，293T 細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞株，用50%雞蛋白提取液共培養(yǎng)3 d 后，BMPR-1A 表達(dá)明顯升高，說明293T 細(xì)胞有向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象發(fā)生，見圖3。

2.4 293T-GFP 有1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 OCT4 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，293T-GFP 用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后，對比培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞OCT4 的表達(dá)明顯增加，說明細(xì)胞有向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。

圖1 C57-BMSC 有3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變(n=3)Fig.1 C57-BMSC has three proteins occurred statistically significant change(n=3)

圖2 TS-UC-MSC 有1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變(n=3)Fig.2 TS-UC-MSC has one protein occurred statistically significant change(n=3)

圖3 293T 有1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變(n=3)Fig.3 293T has one protein occurred statistically significant change(n=3)

2.5 293T 細(xì)胞OCT4 和NANOG 蛋白的Western blot 結(jié)果(圖5) OCT4 和NANOG 蛋白是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，293T 細(xì)胞用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后，OCT4 和NANOG 蛋白的表達(dá)量明顯增加(圖5 和表1)，與對照組(培養(yǎng)基培養(yǎng))相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，n=3)。

圖4 293T-GFP 有1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變(n=3)Fig.4 293T-GFP has one protein occurred statistically significant change(n=3)

圖5 293T 細(xì)胞OCT4 和NANOG 蛋白的Western blot 結(jié)果Fig.5 Western blot results of OCT4 and NANOG protein in 293T cells

3 討論

SOX17、BMPR-1A、NANOG 和OCT4 是干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能的干細(xì)胞時，這幾個蛋白的表達(dá)明顯升高。因此，這些蛋白在細(xì)胞中表達(dá)明顯升高時，可以認(rèn)為細(xì)胞向多能的干細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

表1 293T 細(xì)胞誘導(dǎo)后OCT4 和NANOG 蛋白的相對表達(dá)量(n=3)Tab.1 OCT4 and NANOG protein relative expression in induced 293T cells(n=3)

我們用共培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)加了50%雞蛋白提取液的細(xì)胞有一些干細(xì)胞蛋白表達(dá)明顯升高，而現(xiàn)在用卵細(xì)胞提取液誘導(dǎo)體細(xì)胞核重編程的方法，通常用可逆滲透法，即先用鏈球菌溶血素O(SLO)在細(xì)胞膜上打孔，再用卵細(xì)胞提取液滲透，最后再用氯化鈣再封合細(xì)胞膜上的孔，是否這種方法誘導(dǎo)效率更高，需要今后的實驗進(jìn)一步深入研究。

我們在實驗中用了4 種細(xì)胞，C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(C57-BMSC)、樹鼩的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(TS-UC-MSC)、293T 細(xì)胞(購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)和GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染成功的293T 細(xì)胞(293T-GFP)，用50% 的雞蛋白提取液共培養(yǎng)3 d后，均檢測到了干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的升高，說明了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)細(xì)胞向多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，因為多能標(biāo)志蛋白有意義地升高了。

對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液，雞蛋白提取液獲取更方便，獲取量更大，提取過程注意無菌操作，獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用于細(xì)胞培養(yǎng)，有較大的應(yīng)用價值。在我們以前的研究中，發(fā)現(xiàn)雞蛋白提取液有促細(xì)胞增殖的作用［4，5］，還有促進(jìn)多能因子OCT4 和NANOG 升高表達(dá)的作用［6，7］，因此在本研究中我們進(jìn)一步應(yīng)用干細(xì)胞蛋白芯片檢測更多的多能因子，同時使用4 種細(xì)胞，都檢測到其中多能因子的升高表達(dá)，C57-BMSC 有SOX17、BMPR-1A 和NANOG 這3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，TS-UC-MSC 有BMPR-1A 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，293T 有BMPR-1A 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，293T-GFP 有OCT4 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，進(jìn)一步驗證了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)體細(xì)胞向多能細(xì)胞轉(zhuǎn)變的作用。

由于C57-BMSC 和TS-UC-MSC 是間充質(zhì)干細(xì)胞，它們經(jīng)過誘導(dǎo)后多能因子進(jìn)一步升高表達(dá)，是否證明了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細(xì)胞的特殊物質(zhì)，以及這些物質(zhì)的鑒定和分離提取還有待實驗進(jìn)一步驗證。

［1］Miyamoto K，Tsukiyama T，Yang Y，et al.Cell-free extracts from mammalian oocytes partially induce nuclear reprogramming in somatic cells［J］.Biol Reprod，2009，80(5):935-943.

［2］Hansis C，Barreto G，Maltry N，et al.Nuclear reprogramming of human somatic cells by xenopus egg extract requires BRG1［J］.Curr Biol，2004，14(16):1475-1480.

［3］Miyamoto K，F(xiàn)urusawa T，Ohnuki M，et al.Reprogramming events of mammalian somatic cells induced by Xenopus laevis egg extracts［J］.Mol Reprod Dev，2007，74(10):1268-1277.

［4］阮光萍，王金祥，劉菊芬，等.雞卵清提取液中小于3kDa 的成分有促細(xì)胞增殖的作用［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2014，36(10):1350-1354.

［5］阮光萍，王金祥，龐榮清，等.雞卵細(xì)胞提取液有維持和增強(qiáng)細(xì)胞活性的關(guān)鍵作用［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2013，35(6):804-809.

［6］阮光萍，王金祥，姚 翔，等.雞卵提取物促進(jìn)293T 細(xì)胞升高表達(dá)多能基因OCT4 和NANOG［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2014，36(2):190-194.

［7］阮光萍，姚翔，劉菊芬，等.雞卵清提取液中大于3ku 蛋白促細(xì)胞升高表達(dá)多能基因Oct-3/4 和Nanog［J］.中國組織工程研究，2014，18(37):6029-6033.