ZZ 親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備與初步應(yīng)用①

鮑如夢 趙爽佳 薛 敏 楊洪鳴 唐金寶 (濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，濰坊 261053)

葡萄球菌A 蛋白(Staphylococcal protein A，SpA)是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細(xì)胞壁分離出的一種單一多肽鏈，具有E、D、A、B 和C 5 個高度同源的IgG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域［1］，可與兔、人、鼠等多種哺乳動物血清中IgG 抗體的Fc 段非特異性結(jié)合(對馬、羊等IgG 無親和力)，且這種結(jié)合不影響其Fab 片段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性［2，3］。利用這一特性，以各種標(biāo)記物(如堿性磷酸酶、過氧化物酶、異硫氰酸熒光素等)標(biāo)記SpA，在免疫測定實(shí)驗(yàn)中得到大量應(yīng)用，被稱為“廣泛二抗”［4，5］。近來研究發(fā)現(xiàn)SpA 的5 個高度同源的IgG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，也與某些IgG 的Fab 段結(jié)合［如人IgG1 的F(ab')2］，而以人工修飾的ZZ 結(jié)構(gòu)域(ZZ-domain)代替其5 個結(jié)構(gòu)域，僅保留了與IgG 抗體Fc 段結(jié)合的性能［6，7］，使ZZ 結(jié)構(gòu)域作為親和試劑參與免疫反應(yīng)更為有利。本研究將來自SpA ZZ 結(jié)構(gòu)域的ZZ親和肽基因與堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)基因重組，利用大腸桿菌表達(dá)，制備一種既具有與IgG 抗體結(jié)合活性又具堿性磷酸酶活性的融合蛋白，為構(gòu)建一種特異、簡便和快速的新型免疫親和試劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 pEZZ 18 載體購自Amersham 公司;pDAP2 質(zhì)粒由華中科技大學(xué)沈關(guān)心教授惠贈;E-.coli DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存;各種工具酶為TaKaRa公司或MBI 公司產(chǎn)品;PCR 擴(kuò)增試劑盒購自TaKa-Ra 公司;HisTrap Chelating HP 購自Amersham Biosciences;質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)miga 公司;羊、兔IgG 抗體購自BBI 公司;兔抗鼠MMP-2、羊抗兔IgGAP 均購自武漢博士德生物工程有限公司;BCIP/NBT 堿性磷酸酶購自碧云天公司;其他生化及化學(xué)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 ZZ-AP 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)AP基因序列設(shè)計(jì)引物(F1:5'-GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3'，含Sac I 內(nèi)切酶位點(diǎn);R1:5'-GCTACTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGT-3'，含Pst I 內(nèi)切酶位點(diǎn))以pDAP2 為模板，PCR 擴(kuò)增AP 基因并克隆至pEZZ18 質(zhì)粒Sac I/Pst I 酶切位點(diǎn)，獲得pEZZ-AP 質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coli DH5α，涂布于LB/Amp(氨芐濃度為100 μg/ml)平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆菌落接于5 mL LB/Amp 液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒作Sac I 和Pst I 雙酶切驗(yàn)證并委托上海生工測序。

1.2.2 ZZ-AP 融合蛋白的表達(dá)與純化 pEZZ-AP/E.coli DH5α 工程菌過夜培養(yǎng)后，以1/10 的接種量接于50 ml 新鮮的LB/Amp(氨芐濃度為100 μg/ml)液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)后，6 000 r/min離心10 min，棄菌液，含咪唑20 mmol/L的0.1 mmol/L TBS(Tris 100 mmol/L，NaCl 0.5 mmol/L，pH7.5)溶液重懸菌體，反復(fù)凍融直至菌液變得黏稠，6 000 r/min 離心30 min，取上清12%SDS-PAGE 分析，將上清以1 ml/min 流速通過His-Trap 層析柱，以含咪唑250 mmol/L 的0.1 mmol/L TBS 溶液洗脫并收集洗脫組分，Millipore 超濾離心管(分子截留量10 kD)8 000 r/min 離心，脫鹽濃縮至合適體積，收集液進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.2.3 ZZ-AP 融合蛋白生物學(xué)活性檢測

1.2.3.1 Western blot 羊IgG(分子量約150 kD)、兔IgG(分子量約160 kD)經(jīng)12% 的非還原SDSPAGE 分離后，轉(zhuǎn)至NC 膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，經(jīng)5% BSA溶液封閉30 min，浸入ZZ-AP(0.1 mg/ml)溶液37℃溫育結(jié)合30 min，TBST 洗滌5 次后，加入BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色溶液，在振蕩條件下充分顯色。

1.2.3.2 細(xì)胞免疫組化 本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)染pLIVEmIL-1β 和pLIVE-lacZ(對照)的鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6(Hepa1-6/IL-1β、Hepa1-6/lacZ)，細(xì)胞免疫組化染色法觀測各組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)MMP-2 表達(dá)情況。我們以ZZ-AP 融合蛋白與傳統(tǒng)二抗(山羊抗兔IgGAP)并行分析，目的是檢測ZZ-AP 作為替代標(biāo)記二抗的應(yīng)用效果。Hepa1-6/IL-1β、Hepa1-6/laZ 細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、固定后，0.3% Triton X-100 處理20 min 增強(qiáng)膜透性，正常山羊血清封閉，在被檢標(biāo)本上滴加兔抗鼠MMP-2 多抗液(1∶200)，濕盒4℃過夜。TBS沖洗3 次后，滴加山羊抗兔IgG-AP(1∶500)及ZZAP 工作液(0.1 mg/ml)，37℃溫育30 min;TBS 沖洗3 次，每次10 min，BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色;蘇木素復(fù)染1 min，脫水透明，封片，顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 ZZ-AP 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳顯示在1375 bp 左右有明顯條帶(圖1)，為擴(kuò)增的AP 片段。對經(jīng)PCR 鑒定的陽性克隆進(jìn)行Sac I、Pst I 雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示有目的基因插入(圖1)。對酶切驗(yàn)證正確的克隆基因序列測定，測序結(jié)果表明所擴(kuò)增的AP 與Genebank 所公布的基因序列一致，將AP 基因正確克隆至pEZZ18 的質(zhì)粒命名為pEZZ-AP。

圖1 PCR 產(chǎn)物電泳分析(左)及重組質(zhì)粒pEZZ-EGFP 雙酶切鑒定(右)Fig.1 Analysis of PCR product(left)and restriction enzyme of the recombinant plasmid(right)

2.2 ZZ-AP 融合蛋白的表達(dá)與純化 含質(zhì)粒pEZZ-AP 的E.coli DH5α 菌株37℃振蕩培養(yǎng)12 h 后，取100 μl 菌液離心，對菌體進(jìn)行 SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，與對照菌株相比，pEZZ-AP/E.coli DH5α 在62 kD 左右出現(xiàn)明顯差異條帶，與ZZ-AP融合蛋白理論值相近(圖2，泳道2)。通過反復(fù)凍融菌體破壁釋放目的蛋白，結(jié)果顯示凍融上清含有大量目的蛋白。凍融上清流通上樣HisTrap 層析柱，經(jīng)250 mmol/L 咪唑洗脫目的蛋白，可獲得電泳純度90%以上的ZZ-AP 融合蛋白(圖2，泳道3)。

圖2 12%SDS-PAGE 分析Fig.2 12% SDS-PAGE analysis

圖3 非還原SDS-PAGE and Western blot 分析Fig.3 Non reducting SDS-PAGE and Western blot analysis of ZZ-AP fusion protein

2.3 ZZ-AP 融合蛋白生物學(xué)活性檢測

2.3.1 Western blot 羊IgG、兔IgG 經(jīng)12%的非還原SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜，加入ZZ-AP 孵育洗滌、BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色溶液顯色，結(jié)果如圖3。兔IgG 條帶顯色而羊IgG 條帶未顯色，表明ZZ-AP融合蛋白可特異性結(jié)合兔IgG 抗體而不結(jié)合羊IgG，且具有堿性磷酸酶的酶學(xué)活性。

2.3.2 細(xì)胞免疫組化 在腫瘤細(xì)胞中，IL-1 能夠誘導(dǎo)腫瘤和基質(zhì)成分表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)。我們以ZZ-AP代替標(biāo)記二抗羊抗兔IgGAP，檢測ZZ-AP 作為一種替代二抗的檢測效果。圖4 結(jié)果顯示，Hepa1-6 細(xì)胞經(jīng)蘇木精染色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，與細(xì)胞質(zhì)明顯區(qū)分。轉(zhuǎn)染了pLIVE-mIL-1β的Hepa1-6 細(xì)胞加入兔抗鼠MMP-2 多抗，經(jīng)二抗山羊抗兔IgG-AP 顯色，可看出Hepa1-6/IL-1β 細(xì)胞漿顏色明顯深于Hepa1-6/lacZ 組(對照組)，ZZ-AP 檢測組的顯色模式及著色效果與二抗(羊抗兔IgGAP)相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZZ-AP 可代替標(biāo)記二抗應(yīng)用于免疫分析。

圖4 細(xì)胞免疫組化檢測MMP-2 (×100)Fig.4 Immunocytochemistry of MMP-2(×100)

3 討論

開發(fā)和應(yīng)用新的免疫標(biāo)記物或標(biāo)記方式是免疫學(xué)研究的主要方向之一，傳統(tǒng)免疫標(biāo)記方法是將標(biāo)記物通過化學(xué)交聯(lián)法偶聯(lián)到免疫親和試劑分子上，但這種方法有其缺點(diǎn)［8，9］:需要交聯(lián)、純化等多步蛋白質(zhì)操作，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，且成本高。采用基因工程方法將抗體基因和標(biāo)記物基因融合表達(dá)，獲得既保持抗體活性又有標(biāo)記物活性的雙功能蛋白質(zhì)，不僅易于大量制備、成本低，而且抗體片段與標(biāo)記物融合表達(dá)可最大限度地避免非特異性標(biāo)記和游離標(biāo)記物的存在，降低反應(yīng)本底，也避免了傳統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)中需要分離、純化等復(fù)雜的過程［10］。目前主要研究集中在單鏈抗體(ScFv)與AP 融合蛋白的構(gòu)建［11，12］，但是每檢測一種抗原就要制備相應(yīng)的融合抗體，在不能或不便構(gòu)建抗體-酶融合蛋白時則融合標(biāo)價受阻，因此，尋找一種可結(jié)合多種一抗的抗并與酶以融合表達(dá)方式來制備免疫酶標(biāo)試劑具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)將堿性磷酸酶與ZZ 親和肽融合表達(dá)，借助于ZZ 親和肽與IgG 的Fc 段結(jié)合的廣譜性，可對小分子抗體-AP 融合蛋白產(chǎn)生積極的補(bǔ)充作用，而無須每檢測一種抗原而制備相應(yīng)的抗體融合蛋白。由于時間及樣本的關(guān)系，我們僅對ZZ-AP 融合蛋白做了初步的應(yīng)用效果對比，因此，進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用范圍將是下一步的研究重點(diǎn)。

［1］Moks T，Abrahmsen L，Nilsson B，et al.Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains［J］.Eur J Biochem，1986，156(3):637-643.

［2］Mousli M，Turki I，Kharmachi H，et al.Recombinant single-chain Fv antibody fragment-alkaline phosphatase conjugate:a novel in vitro tool to estimate rabies viral glycoprotein antigen in vaccine manufacture［J］.J Virol Methods，2007，146(1-2):246-256.

［3］Rau D，Kramer K，Hock B.Single-chain Fv antibody-alkaline phosphatase fusion proteins produced by one-step cloning as rapid detection tools for ELISA［J］.J Immunoassay Immunochen，2002，23(2):129-143.

［4］Dahlbom I，Agardh D，Hansson T.Protein A and protein G ELISA for the detection of IgG autoantibodies against tissue transglutaminase in childhood celiac disease［J］.Clin Chim Acta，2008，395(1-2):72-76.

［5］Yuan Y，He H，Lee LJ.Protein A-based antibody immobilization onto polymeric microdevices for enhanced sensitivity of enzymelinked immunosorbent assay ［J］.Biotechnol Bioeng，2009，102(3):891-901.

［6］Jansson B，Uhlen M，Nygren PA.All individual domains of staphylococcal protein A show Fab binding［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，1998，20(1):69-78.

［7］Zheng D，Aramini JM，Montelione GT.Validation of helical tilt angles in the solution NMR structure of the Z domain of Staphylococcal protein A by combined analysis of residual dipolar coupling and NOE data［J］.Protein Sci，2004，13(2):549-554.

［8］Kobatake E，Iwai T，Ikariyama Y，et al.Bioluminescent immunoassay with a protein A-luciferase fusion protein［J］.Anal Biochem，1993，208(2):300-305.

［9］Zhang XM，Kobatake E，Kobayashi k，et al.Genetically fused protein A-luciferse for immunological blotting analysis［J］.Anal Biochem，2000，282(1):65-69.

［10］Tang JB，Zhu P，Yang HM，et al.Expression and secretion of recombinant ZZ-EGFP fusion protein by the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.Biotechnol Lett，2008，30(8):1409-1414.

［11］Volodin MA，Afanas'eva AV，Bokhman Iav，et al.Thermostable placental-type alkaline phosphatase in the malignantly degenerated endometrium［J］.Vopr Onkol，1982，28(6):29-35.

［12］Wang SH，Zhang JB，Zhang ZP，et al.Construction of single chain variable fragment(ScFv)and BiscFv-alkaline phosphatase fusion protein for detection of Bacillus anthracis［J］.Anal Chen，2006，78(4):997-1004.