體外沖擊波聯(lián)合增強(qiáng)型纖維蛋白膠負(fù)載骨生長因子治療兔骨不連的研究

喻紹頂 倪衛(wèi)東 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016)

骨折是常見的創(chuàng)傷，而骨不連、骨折延遲愈合則仍然是臨床上有待解決的難題。由于骨折后導(dǎo)致骨不連的成因復(fù)雜，觀點(diǎn)眾多，其治療方法不一［1］。目前傳統(tǒng)的治療仍為植骨、內(nèi)固定或外固定支架等有創(chuàng)治療［1，2］。反復(fù)多次手術(shù)既增加患者痛苦，又加重病員經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并可發(fā)生供骨區(qū)疼痛、感染等諸多手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥。因此，尋求一種更好的治療方法成為骨不連治療研究的重要課題。

20 世紀(jì)90 年代人們開始將體外沖擊波(Extracorporeal shock wave，ESW)治療應(yīng)用于骨科疾病治療，發(fā)現(xiàn)ESW 治療有刺激成骨的作用，在治療骨折、骨不連方面有較好的療效［3，4］，但由于內(nèi)臟器損傷、損傷大血管及神經(jīng)等多種原因尚不能廣泛應(yīng)用。另外，沖擊波能量選擇是其受限的重要原因，能量過低達(dá)不到治療的目的，能量過高則損傷較重［5］。因此，尋找一種彌補(bǔ)措施成為優(yōu)化該療法的追求目標(biāo)。新近研究表明，骨形成蛋白(BMP)與bFGF 能夠增強(qiáng)彼此的作用，加速了軟骨的成熟和骨化［6］，二者在不同水平和不同環(huán)節(jié)上參與對(duì)骨誘導(dǎo)、骨形成過程的調(diào)節(jié)。另有實(shí)驗(yàn)研究提示，BMP 和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在骨愈合中對(duì)成骨有相互依賴及調(diào)控的作用［7］。我們推測是否聯(lián)合治療可以成為有效的治療手段，是否可以減少體外沖擊波能量的情況下，再通過聯(lián)合應(yīng)用骨形成蛋白、成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等綜合治療方法，同樣可以更有效治療骨不連。

兔性情溫順，便于飼養(yǎng)。同時(shí)，兔的骨骼轉(zhuǎn)化速度快，約達(dá)到了人類的3 倍，因此可以在短期內(nèi)觀察骨折愈合時(shí)骨組織的變化，肱骨橈骨粗大，是制備骨折模型較為常用的動(dòng)物［8］。因此，本課題主要采用兔制備橈骨模型，并行不同方案的治療，包括單純體外沖擊波治療，以及分別聯(lián)合纖維蛋白膠、成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等治療情況下，通過常規(guī)X 線攝片、組織形態(tài)光學(xué)檢查及生物力學(xué)試驗(yàn)等方法檢測沖擊波聯(lián)合藥物治療后的骨折愈合情況。

1 材料與方法

1.1 材料 纖維蛋白膠(FG):由廣州倍繡生物技術(shù)有限公司提供，分為生物膠主體、主體溶解液、催化劑及催化劑溶解液4 部分。人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(rhVEGF):由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2):由廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公提供。重組人堿性成纖維生長因子(rhbFGF):廣東珠海東大生物技術(shù)公司產(chǎn)品。在纖維蛋白膠的溶液中各組分別加入的rh-VEGF、rhBMP-2、rhbFGF 的最終聚合物中，rhVEGF的濃度為0.5 mg/ml，rhBMP-2 的濃度為2.5 mg/ml，rhbFGF 的濃度0.5 mg/ml。普通級(jí)新西蘭兔:體重約2.2～2.5 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［SCXK(渝)2012-0001］提供，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［SYXK(渝)2012-0001］。體外沖擊波碎石機(jī):由重醫(yī)大附一院及沖擊波實(shí)驗(yàn)室提供。該實(shí)驗(yàn)通過重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.2 動(dòng)物分組 取48 只健康成年新西蘭兔，雌雄不限，體重2.2～2.5 kg。隨機(jī)分為A、B、C、D 四組，每組12 只兔，共48 只左側(cè)橈骨模型，手術(shù)造成左側(cè)橈骨缺損骨不連。實(shí)驗(yàn)分為A 組:12 只骨不連給予體外沖擊波治療;B 組12 只骨不連采用FG +體外沖擊波治療;C 組12 只骨不連采用FG/rhBMP-2/rhbFGF+體外沖擊波治療;D 組12 只骨不連采用FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+體外沖擊波治療。

1.3 手術(shù)方法 骨不連模型的制作:20 g/L 戊巴比妥納30 mg/kg 兔耳緣靜脈注射麻醉。俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，褪毛消毒鋪無菌巾。取前臂內(nèi)側(cè)縱行約3 cm 直切口。充分顯露左側(cè)橈骨中段，電鋸造成約10 mm 節(jié)段骨缺損(帶骨膜)，將骨碎屑沖冼干凈，縫合傷口。A、B、C、D 四組標(biāo)記分籠喂養(yǎng)，術(shù)后立即肌肉注射青毒素40 萬U/只，連續(xù)3 d，不予外固定。2 個(gè)月后攝X 線片證實(shí)骨不連模型形成，骨折端硬化，骨折間隙清晰可見。

增強(qiáng)型纖維蛋白膠的制作:將纖維蛋白膠粉劑，配成濃度為40 mg/ml 纖維蛋白膠細(xì)胞懸液。將凝血酶加入已預(yù)熱至37℃的氯化鈣(40 mmol/ml)溶液中，濃度為50 U/ml。配制凝血酶(50 U/ml)、抑肽酶(8 000 U/ml)及氨甲環(huán)酸(20 mg/ml)復(fù)合液。在常溫下將纖維蛋白膠懸浮液里滴入凝血酶、抑肽酶及氨甲環(huán)酸制成增強(qiáng)型纖維蛋白膠。將制成的增強(qiáng)型纖維蛋白膠分成A、B、C、D 四組。在C 組直接加入rhBMP-2 的濃度為2.5 mg/ml，rhbFGF 的濃度0.5 mg/ml 制備成纖維蛋白膠復(fù)合物。在D 組直接加入rhVEGF 的濃度為0.5 mg/ml，rhBMP-2 的濃度為2.5 mg/ml，rhbFGF 的濃度0.5 mg/ml 制備成纖維蛋白膠復(fù)合物。

治療方法:采用能量為0.5 mJ/mm2級(jí)的沖擊波(德國ESWL 沖擊波機(jī))對(duì)A、B、C、D 組進(jìn)行治療，沖擊量為800 次，焦點(diǎn)聚焦范圍1.5 mm2，在透視下調(diào)整沖擊焦點(diǎn)，分別對(duì)骨不連遠(yuǎn)近端邊緣進(jìn)行沖擊。A 組12 只兔采用體外沖擊波治療;B 組12只兔采用FG+體外沖擊波治療;C 組28 只兔采用FG/rhBMP-2/rhbFGF+體外沖擊波治療;D 組12 只兔采用FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+體外沖擊波治療。治療后B 組、C 組、D 組分別在沖擊波治療后經(jīng)皮膚直接注入纖維蛋白膠或復(fù)合物到骨折斷端1次，每次在斷端注入2 ml 纖維蛋白膠或復(fù)合物。采用組間及組內(nèi)對(duì)照并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 效應(yīng)指標(biāo)和資料收集方法

1.4.1 X 線攝片檢查 采用數(shù)碼成像X 線機(jī)分別于沖擊波治療后第4、8 周攝A、B、C、D 組兔患肢正位X 線片，觀察治療前后的X 片變化。

1.4.2 組織光學(xué)檢查 分別于治療后第4、8 周每組各處死動(dòng)物4 只，取骨折間隙組織進(jìn)行光學(xué)檢查。

1.4.3 力學(xué)性能測試 術(shù)后8 周取材。使用Instron 力學(xué)測試機(jī)(美國Model 8874)對(duì)各組修復(fù)兔橈骨骨不連的標(biāo)本進(jìn)行三點(diǎn)抗彎曲負(fù)荷測試。統(tǒng)計(jì)分析比較各組時(shí)的骨缺損修復(fù)性新骨的抗變強(qiáng)度，每組6 例。

2 結(jié)果

2.1 X 線結(jié)果 A 組:單純體外沖擊波治療4 周仍未明顯愈合，可見清晰的骨折線，骨折斷端有大量骨痂形成。8 周時(shí)，骨折線模糊，骨痂面積縮小，多形成于骨間膜和兩側(cè)骨端，缺損距離縮短。B 組:FG+體外沖擊波治療組4 周骨折線模糊，骨折斷端有大量骨痂形成，呈梭型包繞骨不連間隙，缺損區(qū)有云霧樣陰影。8 周，骨折線模糊，外骨痂完全橋接斷端，骨痂面積開始縮小，多形成于骨間膜和兩側(cè)骨端，缺損距離縮短。C 組:FG/rhBMP-2/rhbFGF +體外沖擊波治療組4 周時(shí)骨折線模糊，呈梭型包繞骨不連間隙，缺損區(qū)有云霧樣陰影，骨折斷端可見少量纖維連接。8 周時(shí)未見明顯骨折線，骨折端纖維骨痂消失，由板層骨連接，骨塑形明顯，但骨紋理較亂。D 組:FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+體外沖擊波治療組4 周時(shí)可見骨折線模糊，呈梭型包繞骨不連間隙，缺損區(qū)有云霧樣陰影，骨折斷端可見形成纖維連接，骨小梁明顯增多。8 周時(shí)骨折線消失，可見連續(xù)骨小梁存在并已通過骨折間隙，骨紋理出現(xiàn)較規(guī)律的縱向排列，且愈合后塑形好。見圖1。

圖1 X 線片觀察不同組間骨折愈合情況Fig.1 Observations of X-ray for fracture healing between different groups

圖2 HE 染色觀察不同組間骨折愈合情況Fig.2 Observations of HE staining for fracture healing between different groups

2.2 HE 染色病理結(jié)果 從圖2 我們可以看出，4周后體外沖擊波治療組，可見骨小梁結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域有髓腔樣結(jié)構(gòu)形成。4 周后FG +體外沖擊波治療組大片軟骨形成，軟骨細(xì)胞增生活躍，周圍纖維結(jié)締組織中可見新生血管形成。4 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF+體外沖擊波治療組有散在片狀骨小梁結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞較多，骨組織較少。4 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF/rhVEGF+體外沖擊波治療組新生組織為纖維組織結(jié)構(gòu)，成纖維細(xì)胞豐富，未見成骨。8 周后體外沖擊波治療組可見成熟骨小梁結(jié)構(gòu)，骨基質(zhì)豐富，骨細(xì)胞縮小，可見造血細(xì)胞。8 周后FG +體外沖擊波治療組可見大片軟骨化骨現(xiàn)象明顯，局部區(qū)域骨小梁形成。8 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF +體外沖擊波治療組骨組織成熟度較體外沖擊波治療組稍差，髓腔結(jié)構(gòu)不完整。8 周后FG/rhBMP-2/rhbFGF/rh-VEGF+體外沖擊波治療組仍以纖維結(jié)締組織為主，中間見少量骨組織。

2.3 生物力學(xué)結(jié)果 所有測定標(biāo)本均從橈骨缺損中間部位斷裂，斷端不整齊。生物力學(xué)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大負(fù)荷體外沖擊波組(88.83 ±2.32)與FG +體外沖擊波治療組(95.67 ±3.83)兩組之間并沒有差距，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。與FG +體外沖擊波治療組相比，F(xiàn)G/rhBMP-2/rhbFGF +體外沖擊波治療組(111.67 ±4.76)生物力學(xué)明顯，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與FG/rhBMP-2/rhbFGF+體外沖擊波治療組(126.83 ±5.42)相比，F(xiàn)G/rh-BMP-2/rhbFGF/rhVEGF+體外沖擊波治療差異明顯，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明體外沖擊波聯(lián)合經(jīng)皮注射增強(qiáng)型纖維蛋白膠負(fù)載骨生長因子更能夠提高抗彎曲力度。見表1。

表1 生物力學(xué)檢測結(jié)果Tab.1 Results of biomechanical test

3 討論

對(duì)于骨不連的治療目的，主要在于恢復(fù)骨骼的完整性和連續(xù)性而發(fā)揮其功能。高效、微創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的治療骨不連的方法具有重要意義。根據(jù)聲學(xué)原理和空化效應(yīng)，選擇適當(dāng)?shù)臎_擊波能量和沖擊量可使骨組織及硬化骨碎裂，形成粉碎性微骨折，有利于骨折愈合［9］。但是單純體外沖擊波治療4 周仍未明顯愈合，可見清晰的骨折線，骨折斷端有大量骨痂形成。在8 周時(shí)仍然有骨折線模糊、骨痂面積縮小、缺損距離縮短等特點(diǎn)。說明體外沖擊波在一定程度上可以有效治療骨不連，在骨折愈合過程中，不同時(shí)期表現(xiàn)的療效有差異。Gollwitzer［10］通過檢測兔皮下注射的四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素紅和鈣黃綠素藍(lán)等熒光標(biāo)記混合物的強(qiáng)度，應(yīng)用兔股骨體外沖擊波治療實(shí)驗(yàn)，觀察兔股骨骨折2、4、6 周后應(yīng)用體外沖擊波治療后誘導(dǎo)的新骨形成情況，發(fā)現(xiàn)低能量體外沖擊波可以明顯增強(qiáng)新骨形成超過6 周的時(shí)間，尤其是對(duì)于骨化的影響在第4 周達(dá)到高峰期，隨后有所下降。這些研究說明在不同的研究組中，體外沖擊波治療有效，但是成功率不同。結(jié)合我們的研究可能說明，不同時(shí)期體外沖擊波的療效不同，并且操作的精確性等多種內(nèi)在或外在因素也會(huì)在一定程度上影響體外沖擊波治療骨不連的成功率。

體外沖擊波治療骨不連在臨床上已有應(yīng)用，沖擊波能量選擇是其尚不能廣泛應(yīng)的重要原因之一。以往所用的能量均是根據(jù)沖擊波治療腎結(jié)石的經(jīng)驗(yàn)和估計(jì)而來，這對(duì)于骨不連的治療來說是不準(zhǔn)確的。能量過低達(dá)不到治療的目的，能量過高則損傷較重［11］。近年有研究發(fā)現(xiàn)，BMP、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等因子，它們對(duì)細(xì)胞增殖與分化及新骨的形成都有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用［12］。而通過我們應(yīng)用體外沖擊波同時(shí)應(yīng)用這些因子發(fā)現(xiàn)，從纖維組織結(jié)構(gòu)、成熟骨小梁結(jié)構(gòu)、骨基質(zhì)以及造血細(xì)胞等均可以見明顯改善。并且三種因子綜合應(yīng)用比單純應(yīng)用一種因子輔助療效更加顯著。骨形成蛋白(BMP)是一種高效的骨誘導(dǎo)性物質(zhì)，BMP 是一種可與其他材料配合用于修復(fù)骨缺損的生物材料，是迄今為止最為肯定的高效的骨生長因子［11，13］。bFGF 能促進(jìn)軟骨細(xì)胞前質(zhì)的分化和軟骨細(xì)胞的增殖及成熟，特別它是一種毛細(xì)血管增殖刺激劑，能促進(jìn)毛細(xì)血管向骨移植物中長入，使早期組織中軟骨島數(shù)量增多［14］。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，亦稱血管通透性因子是由正?；蚰[瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，分子量為(34～50)×103D 的二聚體蛋白［13］。VEGF 具有強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的作用，增加血管通透性及血管維持功能，它幾乎參與了血管形成的全過程，有利于新生毛細(xì)血管的生成，為局部材料的降解及新骨的形成創(chuàng)造最佳微環(huán)境，還能提高成骨細(xì)胞的活性和軟骨內(nèi)成骨，從而促進(jìn)骨形成，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間還存在生長因子分泌和旁分泌的相互關(guān)系［15］。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用明顯提高骨折的愈合效果。這些療效增強(qiáng)的原因可能與增強(qiáng)血管通透性、提高骨細(xì)胞活性、軟骨細(xì)胞的增殖等有關(guān)，但是具體機(jī)制仍然需要更多的研究揭示。

體外沖擊波與生長因子聯(lián)合可以有效治療骨不連，除其有上述生物學(xué)效應(yīng)外，還表現(xiàn)為增強(qiáng)其機(jī)械效應(yīng)，在一定程度上可以影響到不同密度骨組織之間產(chǎn)生的能量梯度差及扭拉力。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，體外沖擊波聯(lián)合經(jīng)皮注射增強(qiáng)型纖維蛋白膠負(fù)載骨生長因子比單純沖擊波更能夠提高抗彎曲力度。體外沖擊波可以造成骨膜下點(diǎn)狀出血，產(chǎn)生微骨折和大量細(xì)小的骨碎片并有骨折血腫形成［11］。而多種因子的聯(lián)合應(yīng)用可以幫助消除這些效應(yīng)。這樣雙重作用從而使處于靜止?fàn)顟B(tài)的成骨細(xì)胞和來自髓腔及鄰近軟組織的原始成纖維細(xì)胞發(fā)生聚集和增殖，啟動(dòng)骨愈合。另外，高能沖擊波所造成的骨壞死和所產(chǎn)生的大量碎骨片被吸收而釋放出大量因子，而這些因子往往仍然不能滿足維持骨折愈合過程的因子消耗需要。因此，外源性的這些輔助因子可以增強(qiáng)沖擊波治療效果。還有研究提示，體外沖擊波能使骨細(xì)胞膜發(fā)生擾動(dòng)和Ras 反應(yīng)，使細(xì)胞膜超極化，從而導(dǎo)致特異性骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(CBFAI)、Ⅰ型膠原和骨鈣素mRNA 表達(dá)，最終形成骨結(jié)節(jié)［11］，是否這些外源性因子影響到特異性骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等的表達(dá)，仍然需要進(jìn)一步的研究。

另外，已有研究表明BMP 和VEGF 在骨愈合中對(duì)成骨有相互依賴及調(diào)控的作用，但VEGF 和BMP蛋白在體內(nèi)半衰期短，直接注入體內(nèi)易降解，故外源性單純給予上述蛋白的治療效果有限，如果將上述蛋白與載體復(fù)合在體內(nèi)達(dá)到緩慢持續(xù)釋放可克服單純蛋白治療的缺點(diǎn)。將BMP 與纖維蛋白膠(FG)復(fù)合，是因?yàn)镕G 是一種研究和應(yīng)用較多的BMP 緩釋載體［14］，是BMP 的理想保護(hù)劑，能夠避免體液對(duì)骨生長因子的稀釋及降解，對(duì)于增強(qiáng)BMP 等的穩(wěn)定性，延長釋放時(shí)間具有明確的效果［14］。FG 天然的網(wǎng)狀微觀結(jié)構(gòu)有助于BMP 的附著和BMP 與靶細(xì)胞接觸，其強(qiáng)大的黏著力有利于BMP 的緩慢釋放。而增強(qiáng)型FG(纖維蛋白膠)能夠延緩FG 的降解，使得負(fù)載骨生長因子能夠長時(shí)間釋放。因此在增強(qiáng)型纖維蛋白膠基礎(chǔ)上復(fù)合多種骨生長因子并經(jīng)皮注射聯(lián)合沖擊波治療骨不連可能具有重要意義。

動(dòng)物模型雖然能夠較好地模擬人類骨折時(shí)的狀態(tài)，但由于動(dòng)物機(jī)體與人存在一定差異，并且骨折愈合并不是局部過程，因此在動(dòng)物模型上得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要進(jìn)行臨床試驗(yàn)［2，15］。另外，由于實(shí)驗(yàn)條件、動(dòng)物數(shù)量等多種因素限制，仍然可能存在一些結(jié)果的不精確性?？傊?，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證明，比單一體外沖擊波或因子治療相比，采用體外沖擊波聯(lián)合經(jīng)皮注射增強(qiáng)型纖維蛋白膠負(fù)載骨生長因子治療骨不連能夠加速骨不連愈合，促進(jìn)成骨過程，進(jìn)一步提高骨不連的愈合率。但是，該實(shí)驗(yàn)研究與人體生物學(xué)的相關(guān)性等特點(diǎn)仍然需要更進(jìn)一步的研究和追溯。

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