利福平通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化對大鼠全腦缺血發(fā)揮保護作用①

諶貝貝 曹惠敏 李 蓉 承歐梅 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

利福平是從利福霉素B 中得到的一種半合成抗生素，在神經(jīng)變性疾病的體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)利福平能抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β 和COX-2 等的產(chǎn)生，從而減輕神經(jīng)毒性，對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用［1］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，利福平對全腦缺血再灌注損傷后的保護作用尚未見報道。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦中的巨噬細(xì)胞，也是腦實質(zhì)中唯一的一種免疫細(xì)胞，它們清除受損的神經(jīng)組織、吞噬微生物和細(xì)胞碎片［2，3］。小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激以后產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞介質(zhì)如IL-1β、IL-6 和TNF-α［4，5］。越來越多的證據(jù)表明活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性物質(zhì)參與了腦缺血的病理生理過程［6，7］。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化進而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)可能是治療腦缺血的重點?；谥暗捏w外實驗研究結(jié)果，我們推測，在全腦缺血再灌注損傷后利福平可能通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，進而在全腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此本實驗我們通過建立大鼠全腦缺血動物模型，觀察利福平在全腦缺血中是否具有保護作用，并分析其對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠，體重250～300 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗條件下飼養(yǎng)7 d 適應(yīng)環(huán)境后開始實驗。在手術(shù)前所有實驗動物禁食12 h，手術(shù)后飼養(yǎng)直至處死，飼養(yǎng)條件同手術(shù)前。

1.2 主要藥品與試劑 利福平粉針劑(維夫欣)購自重慶華邦制藥股份有限公司，以生理鹽水溶解為10 mg/ml，每次現(xiàn)配現(xiàn)用。IBA-1 單克隆抗體購自美國GENETEX 公司(貨號:GTX101495)，SABC 試劑盒購自北京中山金橋公司(貨號:SP-9000)，IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.3 實驗設(shè)計及動物分組 實驗大鼠隨機分為:假手術(shù)組(S)、全腦缺血/再灌注組(I/R)、全腦缺血/再灌注+利福平處理組(I/R+RFP)，每組14 只。I/R+RFP 組大鼠在再灌注完成后30 min，按照20 mg/kg 體重劑量給予利福平腹腔注射(i.p)，之后每日給予利福平腹腔注 射1 次(上午9 點)直至處死。假手術(shù)組及模型組在相同時間點給予等量的生理鹽水腹腔注射(i.p)。

1.4 建立大鼠全腦缺血/再灌注模型 采用雙側(cè)頸總動脈夾閉合并系統(tǒng)性低血壓建立全腦缺血/再灌注大鼠模型［8］。實驗動物經(jīng)腹腔注射3.5%的水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉后，仰臥固定，利用眼科剪在頸部做一切口，用玻璃分針游離雙側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸總靜脈，將3F 硬膜外導(dǎo)管插入右側(cè)頸總靜脈至右心房，回抽血液(2.5 ml/100 g)，采用微型動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，20 min 后取下動脈夾，緩慢回輸血液，縫合手術(shù)切口，將動物放入恒溫箱直至蘇醒。假手術(shù)組動物僅分離右側(cè)頸總靜脈和兩側(cè)頸總動脈，但不夾閉雙側(cè)頸總動脈及抽取血液，余步驟同上。

1.5 石蠟組織取材 各組大鼠在術(shù)后第7 天深度麻醉后，剪開胸腔從心尖部插入灌注針至左心室，止血鉗固定針頭，然后先用生理鹽水(4℃)200 ml 沖凈腦內(nèi)血液，再用4%多聚甲醛溶液(4℃)200 ml 灌注固定，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中后固定48 h，修剪腦組織后脫水包埋，在背側(cè)海馬(即前囟3.3～4.5 mm)行連續(xù)冠狀位切片，片厚4 μm，每隔9 張貼片一張，中間9 張組織切片丟棄，即每10 張切片取一張，之后行HE 及免疫組化染色。

1.6 新鮮組織取材 在術(shù)后第3 天將各組大鼠深度麻醉后斷頭處死，在冰盤上迅速取出大鼠海馬組織，錫箔紙包好后做一標(biāo)記，先用液氮速凍，之后放入-80℃冰箱保存以備ELISA 檢測用。

1.7 Morris 水迷宮實驗檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 建模后第7 天進行Morris 水迷宮實驗。該實驗分為兩個階段，共歷時6 d。第一階段，定位測試(定位航行實驗);第二階段，記憶能力測試(空間探索實驗)。定位測試開始前1 天讓大鼠在水池中自由游泳2 min，正式訓(xùn)練時，將大鼠頭對池壁，入水點隨機選擇水池四個象限其中之一，記錄大鼠找到平臺所需的時間(即逃避潛伏期)。如果超過60 s 大鼠仍未找到平臺，引導(dǎo)動物至平臺上停留15 s，并將逃避潛伏期記為60 s。記憶能力測試:在實驗第6天撤除平臺，開始60 s 的記憶能力測試，記錄60 s動物在目標(biāo)象限內(nèi)的跨臺次數(shù)。

1.8 HE 染色觀察組織病理學(xué)形態(tài) HE 染色后，顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，在制備好的石蠟切片中，每隔5 張切片取1 張，共取5張作為一套。所有切片均在400 倍下隨機取5 個非重疊視野，對各個視野的正常細(xì)胞進行計數(shù)，計算出每只大鼠海馬CA1 區(qū)每個高倍鏡視野下的平均正常細(xì)胞數(shù)。

1.9 免疫組織化學(xué)檢測IBA-1 陽性細(xì)胞數(shù)目 免疫組化SP 法檢測海馬組織IBA-1 表達(dá)(IBA-1 標(biāo)記活化的小膠質(zhì)細(xì)胞)，按試劑盒說明書(SP-9000，北京中山金橋)逐項操作。IBA-1 陽性細(xì)胞呈棕黃色，切片選擇及細(xì)胞計數(shù)的方法同HE 染色，計算每只大鼠海馬CA1 區(qū)每個高倍鏡視野下的平均IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.10 ELISA 測定海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達(dá) 向預(yù)存腦組織中加入PBS 冰浴充分勻漿，3 500 r/min 離心15 min 后取上清液采用ELISA 法(雙抗體夾心法)按照試劑盒說明書操作。先向待測樣品孔中加入待測樣品，洗滌后加一抗工作液，充分反應(yīng);洗滌后加酶標(biāo)抗體工作液，充分反應(yīng);洗滌后加入底物工作液，充分反應(yīng)后加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm 波長下讀取吸光度值(OD 值)，以標(biāo)準(zhǔn)品之OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算出腦組織中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量(ng/L)。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實驗檢測全腦缺血/再灌注后大鼠認(rèn)知功能的變化 在定位測試中，與S 組相比，I/R 組大鼠找到平臺的時間顯著延長(P＜0.05)，表明缺血再灌注后動物認(rèn)知功能明顯受損，模型建立成功;與I/R 組相比，I/R +RFP 組的尋臺平均潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，表明在全腦缺血后，及時給予利福平能夠改善大鼠受損的認(rèn)知功能。見表1。

表1 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠逃避潛伏期的影響(±s，秒)Tab.1 Effect of rifampin on escape latency after GCIR(±s，s)

表1 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠逃避潛伏期的影響(±s，秒)Tab.1 Effect of rifampin on escape latency after GCIR(±s，s)

Note:1)P＜0.05 vs s group;2)P＜0.05 vs I/R group.

圖1 空間探索試驗典型軌跡圖Fig.1 Track of space exploration test

表2 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠跨臺次數(shù)的影響(±s)Tab.2 Effect of rifampin on crossings over platform after GCIR(±s)

表2 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠跨臺次數(shù)的影響(±s)Tab.2 Effect of rifampin on crossings over platform after GCIR(±s)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

圖2 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)病理形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)Fig.2 Hippocampus CA1 area pathological morphology in rats after I/R 7 days (HE，×200)

表3 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 神經(jīng)元細(xì)胞計數(shù)(±s)Tab.3 Count of hippocampus CA1 neurons in rats after I/R 7 days (±s)

表3 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 神經(jīng)元細(xì)胞計數(shù)(±s)Tab.3 Count of hippocampus CA1 neurons in rats after I/R 7 days (±s)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

圖3 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)IBA-1 免疫組化染色(SP，×200)Fig.3 Immunohistochemistry of IBA-1 in hippocampus CA1 in rats after I/R 7 days(SP，×200)

表4 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)活化小膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù)(±s)Tab.4 Count of activation microglia in rats hippocampus CA1 after I/R 7 days (±s)

表4 大鼠缺血再灌注7 d 后海馬CA1 區(qū)活化小膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù)(±s)Tab.4 Count of activation microglia in rats hippocampus CA1 after I/R 7 days (±s)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

表5 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠海馬IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s，ng/L)Tab.5 Effect of rifampin on expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats hippocampus after I/R(±s，ng/L)

表5 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠海馬IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s，ng/L)Tab.5 Effect of rifampin on expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats hippocampus after I/R(±s，ng/L)

Note:1)P＜0.05 vs S group;2)P＜0.05 vs I/R group.

在記憶能力測試中，S 組及I/R+RFP 組跨臺次數(shù)明顯高于I/R 組(P＜0.05)，說明S 組及I/R +RFP 組中大鼠對原平臺位置的空間記憶優(yōu)于I/R組。I/R+RFP 組動物跨臺次數(shù)高于I/R 組(P＜0.05)，接近S 組(P＜0.05)，表明利福平能一定程度上改善缺血大鼠的認(rèn)知功能。見圖1、表2。

2.2 HE 染色觀察全腦缺血/再灌注后海馬CA1 區(qū)病理學(xué)改變 S 組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列緊密，細(xì)胞呈圓形，結(jié)構(gòu)清晰，核染色清晰，呈深藍(lán)色;I/R 組出現(xiàn)明顯核固縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，排列松散，數(shù)目明顯減少(P＜0.05)。給予利福平后海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕，較I/R 組有了明顯改善(P＜0.05)。見圖2、表3。

2.3 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 S 組大鼠海馬CA1 區(qū)僅見零星少量IBA-1 陽性細(xì)胞，I/R 組CA1 區(qū)出現(xiàn)大量IBA-1陽性細(xì)胞(P＜0.05)。給予I/R 組大鼠利福平處理后海馬CA1 區(qū)IBA-1 陽性細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。見圖3、表4。

2.4 利福平對全腦缺血/再灌注大鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響 與I/R 組比較，I/R+RFP 組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯下降(P＜0.05)，提示利福平能抑制大鼠全腦缺血再灌注損傷后海馬組織內(nèi)IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)。見表5。

3 討論

大量研究表明利福平在神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和帕金森氏病中具有神經(jīng)保護作用［9］。Kilic等［10］發(fā)現(xiàn)利福平能明顯增加MPP +作用后的多巴胺能神經(jīng)元的存活數(shù)量。而近年的研究進一步表明這可能與利福平減少ROS 的生成，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)相關(guān)［1，11］。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)給予利福平處理后，全腦缺血再灌注大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善，海馬神經(jīng)元損傷減輕，活化膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及炎癥因子的表達(dá)受到一定程度的抑制。因此，利福平改善大鼠缺血后認(rèn)知功能、抑制海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

大鼠全腦缺血/再灌注模型模擬的是臨床上心臟驟停、休克、窒息等疾病發(fā)生的病理生理過程。大鼠在經(jīng)受全腦缺血再灌注后主要損傷的是對缺血敏感的海馬，最后導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的減退［12］。在建立動物模型的過程中我們發(fā)現(xiàn)，抽取完預(yù)定量的血液后，雙側(cè)頸總動脈阻斷5 s 左右，動物的嘴唇及角膜變蒼白，雙側(cè)瞳孔逐漸散大、直接及間接對光反射消失，翻正反射消失。行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠的空間記憶功能有明顯的損傷，同時海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元正常細(xì)胞數(shù)目明顯減少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，核固縮。此外模型組大鼠海馬CA1 區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目也顯著增多，海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達(dá)水平明顯升高。說明本實驗中我們所建立的大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型是成功的。

Morris 水迷宮實驗結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠的平均逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長，利福平干預(yù)組大鼠找到平臺的時間從第1 天起就低于缺血模型組，在第5 天找到平臺的時間與假手術(shù)組相比沒有明顯的差異。在空間探索試驗中，利福平干預(yù)組跨臺次數(shù)也遠(yuǎn)多于模型組。表明利福平能夠促進缺血后大鼠認(rèn)知功能障礙的恢復(fù)。

全腦缺血/再灌注導(dǎo)致的大鼠認(rèn)知功能障礙的主要原因是海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)型壞死［13，14］，既往的研究證實缺血再灌后3 d 就可以看到大量CA1 區(qū)錐體細(xì)胞明顯破壞，海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核固縮、乃至消失，胞漿嗜伊紅深染，且在再灌后7 d CA1 區(qū)遲發(fā)型死亡達(dá)到高峰［8，15］。而CA3 區(qū)對缺血有較好的耐受性，大部分細(xì)胞損害不明顯。因此本實驗采用再灌7 d 作為海馬神經(jīng)元檢測時間點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利福平干預(yù)組海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞明顯增多，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、胞漿深染受到了一定程度的抑制，提示利福平對缺血后的海馬神經(jīng)元損傷有一定的保護作用。

全腦缺血后海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)型死亡與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化密切相關(guān)［16］。近年的研究提示利福平可以通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而提高神經(jīng)元的存活率。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)見大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，利福平干預(yù)組小膠質(zhì)細(xì)胞的活化明顯被抑制。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放的大量炎癥因子如IL-1β、IL-6 和TNF-α 可能是介導(dǎo)腦缺血后組織損傷的一個重要環(huán)節(jié)［17］。我們研究發(fā)現(xiàn)利福平處理后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化受到抑制的同時也伴隨著IL-1β、IL-6 和TNF-α 因子的釋放減少，因此這可能是利福平發(fā)揮腦缺血后保護作用的重要機制之一。

總之，本研究表明利福平對大鼠全腦缺血有明顯的保護作用，其機制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少IL-1β、IL-6 和TNF-α 炎癥因子的釋放有關(guān)，因此可為利福平治療腦缺血提供一定的理論基礎(chǔ)。

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