microRNA-7 基因敲減對小鼠CD4 + SP 細(xì)胞胸腺發(fā)育的影響①

陶弋婧 朱順飛 陳 超 趙娟娟 郭萌萌 張憶雄 秦娜林 徐 林

(貴州省遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室暨貴州省生物治療人才基地，遵義 563000)

胸腺(Thymus)是T 淋巴細(xì)胞分化成熟的中樞免疫器官。來源于骨髓中的淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞，在胸腺中經(jīng)歷復(fù)雜的陽性選擇及陰性選擇后，發(fā)育為成熟的T 淋巴細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞是成熟T 淋巴細(xì)胞的主要群體之一。近年來，已有大量文獻(xiàn)報道，微小RNA(microRNA，miRNA)對胸腺CD4+T 細(xì)胞的發(fā)育以及功能發(fā)揮有著重要的調(diào)控作用［1-4］。如Chong 等［1］發(fā)現(xiàn)在Drosha-/-小鼠胸腺中，CD4+T細(xì)胞發(fā)育明顯異常，提示miRNAs 的表達(dá)對于胸腺中CD4+T 細(xì)胞的發(fā)育具有重要作用。進(jìn)一步研究顯示，胸腺前體細(xì)胞發(fā)育至成熟CD4+T 細(xì)胞的不同階段，特定miRNAs 分子的表達(dá)存在差異［2］。此外，Stahl 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 通過調(diào)節(jié)CD4+Th 細(xì)胞對胸腺來源的天然調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(naturally regulatory T cells，nTreg)抑制作用的敏感性，在后者介導(dǎo)的免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些研究均提示特定的miRNA 分子對胸腺CD4+T 細(xì)胞的發(fā)育和功能具有重要作用。因此，深入探討特定miRNAs 分子在胸腺CD4+T 細(xì)胞發(fā)育中的作用，具有重要的理論意義。

微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是新近報道的miRNA 分子，其在機(jī)體組織器官發(fā)育以及多種腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［5-7］。新近研究表明，miR-7 同樣參與了免疫細(xì)胞以及免疫器官的發(fā)育調(diào)節(jié)，如，Stumpfova 等［8］在體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)中發(fā)現(xiàn)，miR-7 在其成熟過程中高水平表達(dá)，且在活化24 h 后持續(xù)升高。類似的，在本課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-7 在小鼠胸腺、脾臟等免疫器官中存在較高水平［9］，然而，miR-7 對胸腺CD4+SP 細(xì)胞發(fā)育及功能的作用研究至今未見相關(guān)報道。因此，本研究擬利用前期建立的miR-7 基因敲減小鼠模型［10］，觀察miR-7 基因敲減對小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞發(fā)育的影響，并初步探討其意義，以期為后續(xù)深入研究miR-7 在免疫細(xì)胞發(fā)育和功能中的生物學(xué)作用提供重要的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級FVB 小鼠和miR-7KD 小鼠［9］飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［10］;LEGEND MICRO21R 型低溫離心機(jī)(Thermo);IX-51 倒置顯微鏡(Olympus 公司);HE 染色液(泰康醫(yī)療);GalliosAs34195 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter 公司);PE 標(biāo)記Anti-Mouse CD4 抗體、PerCp/Cy5.5 標(biāo)記Anti-Mouse CD8 抗體、PE 標(biāo)記Anti-Mouse CD62L抗體、APC 標(biāo)記Anti-Mouse CD44 抗體、APC 標(biāo)記Anti-Mouse Ki67 抗體及相應(yīng)同型對照(eBioscience公司);Fixation/permeabilization Buffer(eBioscience公司);SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);兔抗鼠ERK1/2 抗體、兔抗鼠P-ERK1/2 抗體、兔抗鼠GAPDH 抗體以及羊抗兔IgG-HRP 標(biāo)記抗體(Cell Signaling 公司);BeyoECL Plus A、B 液(碧云天公司);Propidium Iodide(eBioscience 公司);Western blot 化學(xué)發(fā)光成像儀(Carestream Health 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胸腺體積、重量以及細(xì)胞總數(shù)的檢測 將第7 代8 周齡WT 小鼠和miR-7KD 小鼠采取頸椎脫臼處死。常規(guī)解剖提取其胸腺組織。置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗兩次，稱其重量。后將胸腺制備成單細(xì)胞懸液，并用200 目篩網(wǎng)將單細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，收集細(xì)胞。1 200 r/min 離心10 min，棄上清，用細(xì)胞計數(shù)板在倒置顯微鏡下計數(shù)，并將剩余的單細(xì)胞懸液置于冰上，做流式備用。

1.2.2 HE 染色觀察胸腺的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化 常規(guī)解剖提取小鼠的胸腺組織，制備成石蠟切片，切片烤干后，依次投入二甲苯、乙醇、水中脫蠟至水。然后移入蘇木素中浸染10 min，自來水中清洗10 min，移入乙醇中浸潤5 s;然后移入伊紅液中浸染2 min，70%乙醇洗滌，再進(jìn)行脫水、透明處理。最后中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察胸腺的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變。

1.2.3 FACS 檢測胸腺CD4+SP 細(xì)胞及其CD44 和CD62L 的比例 將胸腺制備成單細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液3 ml，冰上裂解10～15 min，PBS 洗滌后離心，棄上清，分別加入 CD4-PE、CD8-PerCp/Cy5.5、CD62L-PE、CD44-APC 熒光標(biāo)記抗體各1μl，4℃避光孵育30 min。PBS 洗滌兩次胞后FACS 檢測。

1.2.4 FACS 檢測胸腺CD4+SP 細(xì)的核抗原Ki67 的比例 CD4-PE 熒光抗體染色同1.2.3，PBS洗滌兩次后棄上清，加入Fixation Buffer 200 μl，4℃避光孵育30 min，加入Permeabilization Buffer 300 μl及1 μl Ki67-APC 抗體，4℃避光孵育30 min，1 200 r/min 離心10 min，PBS 洗滌兩次，F(xiàn)ACS 上機(jī)檢測。

1.2.5 PI 染色法檢測CD4+SP 細(xì)胞的凋亡情況 CD4-PE 抗體染色同1.2.3，PBS 洗滌2 次后加入PI熒光染料染色，30 min 內(nèi)FACS 檢測。

1.2.6 小鼠胸腺總蛋白提取及Western blot 檢測ERK1/2 總蛋白和P-ERK1/2 表達(dá)水平 常規(guī)解剖提取小鼠的胸腺，并將其剪碎置于冰上。加入RIPA裂解液裂解30 min，4℃12 000 r/min 離心15 min。吸取上清液，蛋白樣品利用BCA 方法定量。加入5 ×上樣緩沖液煮沸10 min，分裝備用。胸腺蛋白提取后，根據(jù)BCA 法測得蛋白濃度加樣，進(jìn)行SDSPAGE 電泳，2 h;將電泳分離的蛋白22 V，30 min 電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%BSA 封閉2 h，PBST 洗膜3次，每次10 min。分別加入1∶1 000 稀釋的Rabbit ERK1/2 和Rabbit P-ERK1/2，4℃孵育過夜。PBST洗膜3 次，每次10 min。加入1∶2 000 稀釋的Anti-Rabbit IgG HRP-linked 孵育1 h，增強(qiáng)型ECL 發(fā)光試劑法檢測蛋白表達(dá)情況。經(jīng)Image J 軟件進(jìn)行灰度值測定與分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上，數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本資料的t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-7KD 小鼠胸腺重量以及細(xì)胞總數(shù)的變化我們首先觀察了WT 小鼠和miR-7KD 小鼠的胸腺大小、重量和細(xì)胞總數(shù)。如圖1 所示，與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺體積明顯減小(圖1A);并且，胸腺重量明顯減輕且細(xì)胞總數(shù)顯著減少(圖1B和C，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 miR-7KD 小鼠胸腺的病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變 我們進(jìn)一步利用HE 染色觀察了miR-7KD 小鼠胸腺病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化。如圖2 所示，與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺低倍鏡下皮髓質(zhì)紊亂，高倍鏡下胸腺皮質(zhì)區(qū)、髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞均減少，且髓質(zhì)區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞增多，這提示其胸腺結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理性改變。

2.3 miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞比例及數(shù)量的變化 FACS 檢測結(jié)果如圖3 所示，與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺中CD4+SP 細(xì)胞比例顯著減少(圖3A 和B，P＜0.01)，且細(xì)胞總數(shù)仍明顯降低(圖3C，P＜0.01)。此外，CD4+CD8+DP細(xì)胞比例改變不顯著(P ＞0.05)，而CD8+SP 細(xì)胞比例明顯降低(圖3A，P＜0.05)。

圖1 miR-7KD 小鼠胸腺大小、重量以及細(xì)胞總數(shù)的變化Fig.1 Changes of volume，weight and total cell counts in miR-7KD mice

2.4 miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞CD44 及CD62L 表達(dá)水平的變化 我們進(jìn)一步用FACS 檢測CD4+SP 細(xì)胞功能相關(guān)分子CD44 及CD62L 表達(dá)水平。如圖4 所示，與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞CD44 的表達(dá)水平明顯增加，而CD62L 的表達(dá)水平減少(P＜0.05)。

2.5 miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞核抗原Ki67的表達(dá)水平變化 我們進(jìn)一步觀察了CD4+SP 細(xì)胞增殖變化情況。如圖4 所示，與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞的核抗原Ki67 比例明顯增加(P＜0.01)。

圖2 miR-7KD 小鼠胸腺的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變(白光，放大倍數(shù))Fig.2 The pathological changes in miR-7KD mice(White，Magnification)

圖3 miR-7KD 小鼠胸腺CD4 + SP 細(xì)胞比例及數(shù)量的變化Fig.3 Change on proportion and counts of CD4 +SP cells in miR-7KD mice

圖4 miR-7KD 小鼠胸腺CD4 +SP 細(xì)胞CD44 及CD62L表達(dá)水平的變化Fig.4 Change on expression level of CD44 and CD62L in miR-7KD mice

圖5 miR-7KD 小鼠胸腺CD4 +SP 細(xì)胞核抗原Ki67 的表達(dá)水平變化Fig.5 Change on expression level of Ki-67 in miR-7KD mice

圖6 miR-7KD 小鼠胸腺CD4 +SP 細(xì)胞凋亡比例變化Fig.6 Change on proportion of PI in miR-7KD mice

圖7 miR-7KD 胸腺總ERK1/2 及P-ERK1/2 的表達(dá)水平變化Fig.7 Change on level of total ERK1/2 and phosphor-ERK1/2 in miR-7KD mice

2.6 miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞凋亡比例改變 我們進(jìn)一步觀察了CD4+SP 細(xì)胞凋亡變化情況。如圖6 所示，與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞的凋亡比例顯著增加(P＜0.01)。

2.7 miR-7KD 小鼠胸腺總ERK1/2 以及磷酸化-ERK1/2 蛋白的表達(dá) 最后，我們進(jìn)一步利用Western blot 技術(shù)檢測了miR-7KD 小鼠胸腺中總ERK1/2 以及磷酸化-ERK1/2 蛋白(P-ERK1/2)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與WT 小鼠相比，miR-7KD 小鼠胸腺總蛋白ERK1/2 以及P-ERK1/2 的表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)。

3 討論

目前，利用基因敲減/敲出(Knock down/Knock out)技術(shù)而獲得基因敲減/敲出動物模型成為當(dāng)今研究特定基因生物學(xué)功能的最重要技術(shù)手段之一［11］。近年來，越來越多的研究也采用此類動物模型來研究特定miRNAs 分子在免疫細(xì)胞發(fā)育、分化和功能中的作用［12-14］。如Henao 等［12］研究發(fā)現(xiàn)將miR-181 敲除后，小鼠胸腺自然殺傷性T 細(xì)胞(Natural killer T cells，NKTs)細(xì)胞的比例明顯降低，且其功能明顯異常，提示miR-181 對于NKT 細(xì)胞的發(fā)育和功能具有重要調(diào)控作用;類似地，我們前期也利用miRNA 海綿體(miRNA-sponge，miR-SP)技術(shù)構(gòu)建了miR-126 的基因敲減小鼠，且發(fā)現(xiàn)miR-126 敲減后，可顯著影響小鼠腸系膜淋巴結(jié)中T 淋巴細(xì)胞的比例和活化狀態(tài)，提示miR-126 對于腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞的組成和功能具有重要調(diào)控作用［13］。新近，我們還成功構(gòu)建了miR-7 基因敲減小鼠模型［10］，這為進(jìn)一步深入探討miR-7 在包括CD4+T 細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞發(fā)育和功能中的生物學(xué)作用提供了重要的技術(shù)平臺。

在本研究中，我們利用該小鼠模型首次發(fā)現(xiàn)miR-7 基因敲減后，小鼠胸腺的體積明顯減小，且重量和細(xì)胞總數(shù)均顯著降低。此外，miR-7KD 小鼠胸腺的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理性改變。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)miR-7KD 小鼠胸腺中CD4+SP 細(xì)胞的比例和總數(shù)均較WT 小鼠顯著減少，提示miR-7 參與了CD4+SP 細(xì)胞發(fā)育過程的調(diào)控。類似地，Lykken 等［14］報道m(xù)iR-181a 可以通過調(diào)節(jié)TCR 信號的強(qiáng)度，促進(jìn)CD4+T 及CD8+T 細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程。為了進(jìn)一步探討miR-7 基因敲減對CD4+SP 細(xì)胞胸腺發(fā)育的影響，我們檢測了其相關(guān)功能分子CD44及CD62L 的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-7KD 小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞CD44 的表達(dá)水平明顯增加，而CD62L 的表達(dá)水平減少，提示miR-7 敲減改變了胸腺CD4+SP 細(xì)胞的活化狀態(tài)。進(jìn)一步檢測顯示，miR-7KD 小鼠胸腺中CD4+SP 細(xì)胞Ki67 的表達(dá)水平顯著升高，而PI 陽性率也增加顯著。Ki67 是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的核抗原，其陽性率可有效判斷細(xì)胞增殖活性的高低［15］。這些結(jié)果提示miR-7 基因敲減后CD4+SP 細(xì)胞的減少可能與其體內(nèi)過度活化后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。Yi 等［16］研究也發(fā)現(xiàn)，miR-155 敲出后CD4+T 細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)均顯著減少，該現(xiàn)象與CD4+T 細(xì)胞活化、增殖功能改變有關(guān)。

胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK 家族的一員，其相關(guān)信號途徑傳遞是組織細(xì)胞正常發(fā)育、生長以及分化的關(guān)鍵［17］。已有大量研究表明，包括CD4+T 細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的發(fā)育分化和凋亡均與ERK 信號途徑的改變密切相關(guān)［18，19］。如Dillon 等［18］研究報道，敲除胸腺細(xì)胞內(nèi)B-Raf 可導(dǎo)致胸腺細(xì)胞急劇減少，進(jìn)一步檢測顯示DP 細(xì)胞分化為SP 細(xì)胞過程存在障礙。機(jī)制上的研究表明該效應(yīng)與B-Raf 敲除引起細(xì)胞內(nèi)ERK 信號通路活化顯著下調(diào)有關(guān)［18］。與之對應(yīng)的是，本研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-7KD 小鼠胸腺DP細(xì)胞比例并未發(fā)生變化。重要的是，miR-7KD 小鼠胸腺總蛋白ERK 以及P-ERK 的表達(dá)均顯著下調(diào)，據(jù)此，我們推測miR-7 可能通過改變ERK 信號途徑來調(diào)控DP 細(xì)胞向CD4+SP 細(xì)胞發(fā)育，并影響該群體細(xì)胞的活化和凋亡，最終參與其發(fā)育過程。有意思的是，我們也觀察到miR-7 小鼠胸腺中CD8+SP細(xì)胞比例顯著減少。因此，miR-7 調(diào)控CD4+SP 細(xì)胞發(fā)育的確切機(jī)制仍有待后續(xù)研究闡明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-7 敲減后可顯著影響小鼠胸腺CD4+SP 細(xì)胞的發(fā)育，這為后續(xù)深入探討miR-7 在免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能中的作用及機(jī)制提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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