C3a、C5a 受體缺失減輕IgA 腎病腎損傷①

晏現(xiàn)麗 張 穎 鄭立運(yùn) 任凌燕 周雅麗 權(quán)松霞 邢國(guó)蘭

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，鄭州 450052)

IgA 腎病為亞太地區(qū)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾?。?］，對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的探究雖歷經(jīng)了近半個(gè)世紀(jì)，但目前發(fā)病機(jī)制仍不明確。既往研究多聚焦于IgA 分子的異常糖基化，然而IgA 分子的異常并非IgA 腎病唯一及主要發(fā)病機(jī)制［2］。有文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)體可能是參與IgA 腎病發(fā)病的關(guān)鍵因素［3］。我課題組前期臨床研究中已發(fā)現(xiàn)C3a、C5a 在IgA 腎病病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用［4］，本研究旨在進(jìn)一步探討C3a、C5a 在IgA 腎病發(fā)病中作用的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 6～8 周齡BALB/c 雌性小鼠28 只，SPF 級(jí)，體重18～23 g，7 只/組，其中野生型及陰性對(duì)照組購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，C3a受體敲除組及C5a 受體敲除組小鼠通過(guò)南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院代購(gòu)于美國(guó)Jackson 實(shí)驗(yàn)室。仙臺(tái)病毒由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所惠贈(zèng)，9 日齡SPF 級(jí)活雞胚購(gòu)于北京梅里業(yè)維通實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司。

1.2 仙臺(tái)病毒的擴(kuò)增及血凝價(jià)測(cè)定 0.2 ml 仙臺(tái)病毒濃縮液中加入1 ml 無(wú)菌生理鹽水稀釋后混勻，取0.15 ml 稀釋液接種于雞胚尿囊腔，接種后雞胚置于37℃恒溫箱中孵育，24 h 后觀察雞胚生長(zhǎng)情況，活雞胚繼續(xù)孵育28 h 后取出置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日吸取尿囊液3 000 r/min，4℃離心25 min，吸取上清。所獲病毒液參照以往方法［5］測(cè)定血凝價(jià)。

1.3 小鼠IgA 腎病模型建立 小鼠置于河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室IVC 系統(tǒng)中適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，開(kāi)始給予有活性病毒滴鼻，1 次/周，持續(xù)14 周(病毒量:第1、2 次2.5 ×104，第3 次2.5 ×105，第4次2.4 ×106，第5 至14 次均為1.92 ×108)，第6 及14 次同時(shí)給予含有6.25 ×108個(gè)病毒粒子混懸液尾靜脈注射;陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)間給予等量PBS 液;實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠自由采食、飲水。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定 分別于實(shí)驗(yàn)前及第15 周末于代謝籠中收集24 h 尿，采用CS400 自動(dòng)生化儀檢測(cè)24 h 尿蛋白量。實(shí)驗(yàn)前一天采用毛細(xì)管通過(guò)眼球后靜脈取血，0.2～0.3 ml/只;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(0.1 ml/25 g)，摘取眼球取血，0.8～1.2 ml/只，所取血液于4℃冰箱靜置2 h，3 000 r/min，4℃離心10 min，取上清，采用CS400 自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清尿素氮、肌酐值。

1.5 腎臟組織病理學(xué)檢查 10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(0.1 ml/25 g)，沿腹中線剖開(kāi)腹腔，取出腎臟，剝離腎包膜，沿矢狀面剖開(kāi)腎臟，再沿橫斷面切開(kāi)腎臟，冰生理鹽水沖洗，取1/4 腎臟置于4%中性甲醛中固定，4℃過(guò)夜后石蠟包埋，制成3 μm 厚切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色、過(guò)碘酸-希夫(PAS)染色、馬松三色(Masson)染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎小球病理改變即免疫復(fù)合物沉積情況。取部分腎皮質(zhì)包裹于濕生理鹽水紗布中，OCT 包埋后制成4 μm厚冰凍切片，室溫下涼片20 min，滴加異硫氰酸(FITC)標(biāo)記的IgA 抗體(STAR137F AbD Serotec)及C3 抗體(sc-58926 Santa Cruz)，采用直接免疫熒光法檢測(cè)腎臟中IgA、C3 沉積情況。

1.6 腎組織中IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β mRNA 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) Trizol 法提取腎組織總RNA，測(cè)A(260nm)/A(280nm)值為1.8～2.0，凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA 的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SK2425 上海生工)反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系20 μl:SybrGreen qPCR Maste Mix 10 μl，PCR 上、下游引物各1.0 μl，滅菌蒸餾水6.0 μl，cDNA 模板2.0 μl。反應(yīng)條件:第1 階段，預(yù)變性95℃3 min;第2 階段，PCR 反應(yīng)(95℃15 s，60℃40 s)40 個(gè)循環(huán);第3 階段，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s;得到每個(gè)樣品的Ct 值。采用2-ΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，采用GAPDH 作為內(nèi)參基因。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 法，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Tab.1 Primers of RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中四組小鼠均無(wú)死亡，實(shí)驗(yàn)組小鼠在第4 次給予病毒后出現(xiàn)活動(dòng)減少，體重下降，部分小鼠喜蜷縮，毛發(fā)無(wú)光澤，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有小鼠無(wú)鼻腔膿性分泌物及肉眼血尿。

2.2 各組24 h 尿蛋白量及腎功能比較 建模后實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較尿蛋白量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;C3a 受體敲除組、C5a 受體敲除組與野生型組比較尿蛋白量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;四組之間血清肌酐及尿素氮及血清肌酐差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3 各組小鼠腎組織免疫熒光沉積強(qiáng)度 實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小球有較強(qiáng)IgA沿腎小球系膜區(qū)沉積，且野生型組熒光沉積強(qiáng)于其他兩組，陰性對(duì)照組則無(wú)IgA 沉積;C3 沉積情況同IgA，見(jiàn)圖1。

2.4 各組小鼠腎臟組織病理改變 實(shí)驗(yàn)組小鼠腎組織均有不同程度的系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)增多，部分伴有間質(zhì)灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及小血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹;系膜區(qū)可見(jiàn)嗜復(fù)紅蛋白沉積;且野生型組病理改變較C3a 受體敲除組及C5a 受體敲除組明顯;陰性對(duì)照組未見(jiàn)上述病理改變，見(jiàn)圖2 。

圖1 各組小鼠腎臟組織熒光沉積(×400)Fig.1 Deposition of IgA and C3 in glomerulus of four groups(×400)

圖2 各組小鼠腎臟組織病理改變(PAS 染色，×400)Fig.2 Renal pathology of four groups (PAS，×400)

表2 各組小鼠血清肌酐、尿素氮及24 h 尿蛋白量比較Tab.2 Serum blood urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)and 24 hours urine total protein(UTP)of different groups at weeks 0 and 14

圖3 各組小鼠腎臟組織炎癥因子及細(xì)胞因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative mRNA expression of inflammatory factors and cytokines in renal tissue

2.5 各組小鼠腎臟組織中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6、MCP-1mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組小鼠腎組織炎癥因子及細(xì)胞因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組，同時(shí)野生型組高于C5a 受體敲除組及C3a 受體敲除組，另外IL-1β、IL-6、MCP-1 的mRNA相對(duì)表達(dá)量C5a 受體敲除組高于C3a 受體敲除組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

3 討論

IgA 腎病1968 年由學(xué)者Berger 等提出，雖已歷經(jīng)近半個(gè)世紀(jì)，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。本研究參照學(xué)者Emancipator 等［6，7］所采用方法建立小鼠IgA腎病模型，在此基礎(chǔ)上探究C3a、C5a 及其受體在IgA 腎病發(fā)病中的作用及其潛在機(jī)制。

有文獻(xiàn)證實(shí)補(bǔ)體旁路途徑及甘露糖結(jié)合凝集素途徑參與IgA 腎病發(fā)病，而C3a、C5a 是補(bǔ)體活化過(guò)程中所產(chǎn)生的主要致炎產(chǎn)物，有文獻(xiàn)報(bào)道［8-10］C3a、C5a 參與了缺血再灌注腎損傷、過(guò)敏性哮喘、糖尿病腎病等疾病發(fā)病，然而其在IgA 腎病中作用報(bào)道較少。余學(xué)清等［11］發(fā)現(xiàn)編碼補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子H 因子及其受體的基因異常與IgA 腎病發(fā)病相關(guān)。我課題組［4］在前期的臨床回顧分析中也發(fā)現(xiàn)腎臟局部C3a、C5a 沉積強(qiáng)度及C3a 受體、C5a 受體表達(dá)強(qiáng)度與腎臟病理改變嚴(yán)重程度正相關(guān)。本研究中也發(fā)現(xiàn)C3a 受體敲除及C5a 受體敲除組小鼠在蛋白尿量、腎臟組織病理改變上均輕于野生型組。

C3a 受體及C5a 受體缺失主要通過(guò)阻止C3a 及C5a 與其結(jié)合減少炎癥因子及趨化因子分泌減輕腎臟損傷，其中C3a 受體缺失在減輕腎損傷方面發(fā)揮更強(qiáng)作用。Bao 等［12］發(fā)現(xiàn)C3a、C5a 在補(bǔ)體介導(dǎo)的腎小管腎間質(zhì)損傷中發(fā)揮不同作用，C3a 受體缺失在減少腎小管間質(zhì)中T 淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的作用較C5a 受體缺失更顯著;Engelke 等［9］也發(fā)現(xiàn)C3a 受體缺失與C5a 受體缺失相比減少I(mǎi)L-1β 分泌的作用更強(qiáng)。我課題組［4］的前期研究中也發(fā)現(xiàn)腎臟局部C3a 受體表達(dá)陽(yáng)性率與IgA 腎病24 h尿蛋白量及腎臟病理級(jí)別的相關(guān)性比C5aR 顯著。本研究中也發(fā)現(xiàn)C3a 受體缺失組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于C5a 受體缺失組，由于IL-1β、IL-6、MCP-1 主要由單核/巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞分泌［13］，既往研究又表明C3a 在趨化T 細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞方面作用強(qiáng)于C5a，有意思的是本研究中并未發(fā)現(xiàn)C3a 受體敲除組與C5a受體敲除組小鼠在24 h 蛋白尿及腎臟病理改變上存在差異，這可能與本研究中所采用模型IgA 腎病病理改變本身較輕微，未見(jiàn)明顯腎小球硬化及腎小管間質(zhì)病變等較重病理改變，再者，本研究所采用小鼠為C3a/C5a 受體單敲，敲除一種補(bǔ)體片段受體情況下不能完全排除另一種補(bǔ)體作用的干擾。

綜上所述，C3a、C5a 均參與IgA 腎病發(fā)病，C3a受體及C5a 受體缺失可減輕IgA 腎病腎損傷，同時(shí)C3a 在IgA 腎病發(fā)病中作用強(qiáng)于C5a。

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