中性粒細(xì)胞CD64、CD32 指數(shù)在肝硬化并自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎診斷中的價(jià)值

鄒金海 孔祥軍 李春英 孫鑫義 劉晨第 (河北省滄州市中心醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，滄州 061001)

肝硬化住院患者中有25%到47%會(huì)發(fā)生細(xì)菌感染，感染的發(fā)生會(huì)進(jìn)一步觸發(fā)全身性炎癥和器官衰竭，其死亡率是不發(fā)生細(xì)菌感染患者的4 倍，感染如向多器官衰竭和敗血癥休克進(jìn)展，則肝硬化患者的死亡率將超過75%［1］。而自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(Spontaneous bacterial peritonitis，SBP)是肝硬化失代償期患者比較常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，SBP 會(huì)加重肝硬化患者肝功能的失代償程度，預(yù)后差。肝硬化患者發(fā)生SBP 的處置難點(diǎn)在于感染的診斷，受感染者腹水培養(yǎng)陽性率在50%～70%，在肝硬化失代償期，常規(guī)的臨床參數(shù)不能對(duì)感染做出鑒別診斷，經(jīng)常延誤細(xì)菌感染的診斷和治療［2-4］。然而在臨床上通常在未得到感染的證據(jù)之前就已開始應(yīng)用廣譜抗生素進(jìn)行治療，且隨著臨床癥狀進(jìn)展，抗生素也在不斷升級(jí)，因此必須找到能夠幫助臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確地做出處置決定的診斷肝硬化并自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的新工具。本文回顧分析了165 例肝硬化腹水患者中性粒細(xì)胞表面CD64、CD32 指數(shù)(nCD64 ID、nCD32 ID)與細(xì)菌感染的關(guān)系，并與血清CRP 等炎性指標(biāo)進(jìn)行比較，探討其在肝硬化并發(fā)自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎早期診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2013 年9 月至2013 年12 月收治失代償期肝硬化腹水的患者，分為SBP 組和腹水非SBP 組，入選病例數(shù)共156 例，其中SBP組103 例，患者急診入院，病史時(shí)間≤48 h，乙型肝炎肝硬化患者86 例，丙型肝炎肝硬化患者17 例;非SBP 組53 例，乙型肝炎肝硬化患者44 例，丙型肝炎肝硬化患者9 例。

1.2 肝硬化及SBP 診斷依據(jù) 肝硬化的診斷符合2000 年西安全國第十次病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議方案的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。SBP 的診斷依據(jù)為:(1)有腹痛、發(fā)熱、腹部壓痛及反跳痛等;(2)腹水常規(guī)檢查白細(xì)胞＞0.3 ×109L-1，中性粒細(xì)胞比值＞0.25 L-1，腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽性;(3)腹水常規(guī)檢查白細(xì)胞＞0.3 ×109L，中性粒細(xì)胞比值＞0.25，結(jié)合臨床可診斷自發(fā)性腹膜炎;(4)排除結(jié)核性、繼發(fā)性腹膜炎或腫瘤性腹水。符合(2)(4)或(1)(3)(4)可做出診斷［6］。

1.3 標(biāo)本采集 患者急診入院后48 h 內(nèi)采集外周血進(jìn)行CRP 檢測，腹腔穿刺術(shù)無菌采集10 ml 腹水進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，100 ml 腹水進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.4 CD64 和CD32 檢測 腹水經(jīng)離心濃縮后以磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2-7.4)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至(1～2)×106個(gè)/ml，50 μm 尼龍篩網(wǎng)過濾，離心濃縮至細(xì)胞數(shù)不少于1 ×107個(gè)/ml。分別取100 μl 細(xì)胞懸液2 管，分別加入以下兩組抗體(所加熒光抗體的體積根據(jù)試劑盒使用說明書進(jìn)行)，抗體組合為CD45-PerCP+CD64-PE+CD14-FITC 和CD45-Per-CP+CD32-FITC+CD14-FITC，充分混勻，室溫下避光放置20 min，然后加入紅細(xì)胞裂解液，避光孵育10min，PBS 洗滌2 次，上機(jī)檢測采用側(cè)向角散射光信號(hào)(Side scatter，SSC)和CD45 設(shè)門檢測中性粒細(xì)胞群CD64、CD32 陽性細(xì)胞數(shù)及PMN、Lym、Mo 平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescent intensity，MFI)。采用FCS Express V3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)。

1.5 nCD64 和nCD32 指數(shù)計(jì)算方法

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 4 統(tǒng)計(jì)分析軟件和SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，均值采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve，ROC)分析CD64、CD32指數(shù)診斷細(xì)菌感染的敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 SBP 組與非SBP 組nCD32、nCD64 及CRP 的比較 SBP 組nCD32 為(44 829 ±6 234)mol/cell，nCD64 為(12 942 ±1 698)mol/cell，CRP 為(26.76±4.25)mg/L，WBC 為(11.5 ±2.3)×109L-1;非SBP 組nCD32 為(5 638 ±2 274)mol/cell，nCD64 為(1 028 ±159)mol/cell，CRP 為(3.84 ±0.92)mg/L，WBC 為(5.2 ±1.1)×109L-1，各參數(shù)兩組之間比較均有顯著性差異(P＜0.001)，見表1。

2.2 nCD32、nCD64 和CRP 對(duì)于肝硬化并發(fā)自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎鑒別診斷的敏感性和特異性 將SBP組與非SBP 組患者的nCD32 指數(shù)、nCD64 指數(shù)及CRP 值做ROC 曲線，根據(jù)ROC 曲線，計(jì)算得出nCD32、nCD64 及CRP 的最佳截?cái)嘀捣謩e為(8.39±1.28)、(2.86 ±0.69)、(8.92 ±2.83)mg/L，敏感性分別為:82.8%、96.2%、72.5%，特異性分別為:81.0%、95.8%、73.1%，見表2、圖1。

表1 SBP 組與非SBP 組CD32、CD64 和CRP 的比較Tab.1 Comparison of CD32/CD64/CRP in SBP group and that in non-SBP group

表2 nCD32、nCD64 和CRP 鑒別肝硬化并發(fā)自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的敏感性和特異性比較Tab.2 Comparison of nCD32/nCD64/CRP in sensitivity and specificity in identification of cirrhotic ascites complicated with SBP

圖1 CD32、CD64 和CRP 鑒別肝硬化并發(fā)自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of nCD32/nCD64/CRP in identification of cirrhotic ascites complicated with SBP

3 討論

SBP 是肝硬化失代償期腹水患者的最主要并發(fā)癥之一。其發(fā)病機(jī)制主要是細(xì)菌易位，腸道細(xì)菌及其產(chǎn)物通過受損的腸黏膜屏障到達(dá)血液循環(huán)，出現(xiàn)全身細(xì)菌及其產(chǎn)物播散。病死率約20%。所以細(xì)菌感染的早期診斷和治療是對(duì)臨床醫(yī)生的巨大挑戰(zhàn)，不同原因引起的感染通過臨床癥狀往往很難區(qū)分［7］。對(duì)于細(xì)菌感染的錯(cuò)誤判斷會(huì)導(dǎo)致治療的延誤，從而引起感染患者的死亡，對(duì)于未發(fā)生細(xì)菌感染的患者應(yīng)用抗生素不僅無效，還可能導(dǎo)致耐藥、毒副作用、過敏等不良反應(yīng)以及較高的住院費(fèi)用，因此對(duì)于細(xì)菌感染臨床上需要一種敏感性和特異性高的具有診斷價(jià)值的生物標(biāo)記。

中性粒細(xì)胞是急性炎癥反應(yīng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞，IgG 的Fc 受體(FcγR)能夠激活中性粒細(xì)胞發(fā)揮其功能并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，F(xiàn)cγR 通過與IgG 相互作用能夠介導(dǎo)多種免疫原性反應(yīng)［8］。在人體內(nèi)，每個(gè)FcγR 都含有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，即一個(gè)含有2 個(gè)FcγRIIa(CD64)或3 個(gè)FcγRIa(CD32)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，一個(gè)短的疏水結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)尾，F(xiàn)cγRIIa 是一種結(jié)合于IgG1/3/4 單體的高親和性受體;FcγRIIa(CD32)親和性較低，只作用于IgG 的復(fù)合體或聚集體，CD32 通過IgG 抗體的Fc 識(shí)別區(qū)將活化信號(hào)傳遞到NK 細(xì)胞和髓細(xì)胞，從而使先天性免疫和獲得性免疫緊密聯(lián)系在一起［9］。當(dāng)被某些受體觸發(fā)后FcγR 通過免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)連接到酪氨酸蛋白激酶活化的信號(hào)通路以調(diào)控細(xì)胞代謝和身體機(jī)能。FcγRIa 通過與γ 鏈非共價(jià)結(jié)合而獲得這種功能，F(xiàn)cγRIIa 則與其他Fc 受體或大多數(shù)免疫受體不同，它們是通過配體結(jié)合鏈連接到ITAM 的［10］。

FcγRI(CD64)是一種分子量為72 kD 的蛋白質(zhì)，只表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞系中抗原提呈細(xì)胞的表面，在正常中性粒細(xì)胞表面表達(dá)量較低。通過流式細(xì)胞儀分析中性粒細(xì)胞表面的CD64 被認(rèn)為是一種很好的鑒別細(xì)菌感染的診斷方法，nCD64在細(xì)菌細(xì)胞壁成分、IFN-γ 和G-CSF 等的刺激下表達(dá)量急劇升高，如果清除刺激因素或經(jīng)過有效的抗生素治療，CD64 的表達(dá)會(huì)在48 h 內(nèi)逐漸降低并在7 d 內(nèi)達(dá)到正常水平［11］，因此nCD64 的表達(dá)量可作為細(xì)菌感染患者抗生素治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)［12］。另外nCD64 在室溫下可穩(wěn)定保存至少30 h，在4℃可穩(wěn)定保存72 h［13］，同時(shí)CD64 分析所需樣本量較小、2 h 內(nèi)可完成、操作簡便，為CD64 作為細(xì)菌感染的早期鑒別診斷指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。本研究通過檢測并發(fā)自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的肝硬化患者和未發(fā)生腹水感染的對(duì)照組中性粒細(xì)胞CD64 指數(shù)發(fā)現(xiàn)，nCD64對(duì)診斷SBP 具有很高的敏感度(96.2%)和特異度(95.8%)。說明CD64 的表達(dá)是診斷肝硬化SBP 的一個(gè)有效標(biāo)志，對(duì)SBP 的鑒別診斷、病情判斷、治療效果評(píng)價(jià)以及預(yù)后評(píng)估具有較高的應(yīng)用價(jià)值。nCD64 對(duì)于是否發(fā)生細(xì)菌感染進(jìn)行鑒別診斷的敏感性和特異性均較高，是一種有效的細(xì)菌感染鑒別診斷指標(biāo)。

FcγRII/CD32 是35 年前發(fā)現(xiàn)于造血細(xì)胞表面的一種分子量為40 kD 的糖蛋白［12］，能夠?qū)Ⅲw液免疫和細(xì)胞免疫聯(lián)系起來，以使免疫球蛋白激活巨噬細(xì)胞(吞噬作用)、NK 細(xì)胞(ADCC)、中性粒細(xì)胞(活化)和B 細(xì)胞(抗體提呈)的免疫應(yīng)答。CD32 的表達(dá)受TNF-α、Th1 和Th2 類細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。INF-γ 和G-CSF 能夠上調(diào)中性粒細(xì)胞CD64 的表達(dá)，已有研究表明CD64 是新生兒敗血癥的生物標(biāo)記，同時(shí)在腹部敗血癥以及需要重癥監(jiān)護(hù)的患者體內(nèi)表達(dá)量升高［14］。FcγRIIa 在免疫系統(tǒng)中所有類型細(xì)胞表面均有表達(dá)［15］，如所有的髓細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞等。有研究表明FcγRIIa 在瘧疾感染的血液期能夠激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答［16，17］。血清CRP 水平是臨床常用的炎癥指標(biāo)，但除細(xì)菌感染外，在急性創(chuàng)傷、腫瘤、心肌梗死、結(jié)締組織病等疾病中也會(huì)急劇升高，因此血清CRP 水平在細(xì)菌感染診斷與鑒別診斷中的特異性較差。本研究發(fā)現(xiàn)，SBP 組與非SBP 組nCD32、nCD64 及CRP 的比較均有顯著性差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，從敏感性及特異性方面來看，腹水nCD64 的敏感性和特異性最高，其次為nCD32，血清CRP 最低，三者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，nCD64 指數(shù)可作為細(xì)菌感染診斷的重要指標(biāo)之一，從而更好地指導(dǎo)抗生素的使用，避免濫用抗生素，減少耐藥菌的產(chǎn)生。

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