RNA 干擾Fascin1 表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 MG 的侵襲、轉(zhuǎn)移能力

李培棟 王新軍 單 嶠 吳躍輝 王 振 (鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450052)

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中占50%以上［1］。近年來，盡管在膠質(zhì)瘤的多模式治療方面有很大的進(jìn)步，但其臨床治療效果及生存率仍不夠理想［2］。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高浸潤特性——侵襲腫瘤周圍的大腦實(shí)質(zhì)，是治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)主要原因［3，4］。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，是一個(gè)多因子參與的過程。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，這也是調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的重要機(jī)制之一［5］。Fascin1 是肌動(dòng)蛋白結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白，它參與細(xì)胞絲狀偽足形成，很可能促進(jìn)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。生理狀態(tài)下，F(xiàn)ascin1 在大腦的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較高［6-9］。Fascin1 的異常表達(dá)增高可見于乳腺癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等腫瘤中［10-13］。有研究指出，F(xiàn)ascin1 的表達(dá)增高與膠質(zhì)細(xì)胞瘤的分級(jí)相關(guān)［14，15］。Jeong Hyun Hwang 等也在研究中表明，F(xiàn)ascin1 參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲時(shí)的細(xì)胞形態(tài)重塑與骨架重塑。然而，關(guān)于異常增高的Fascin1 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的機(jī)制，我們知之甚少。

因此，在本研究中，我們應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 MG 中的Fascin1 特異性地表達(dá)降低，評(píng)估其對(duì)U87 MG 細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響，并進(jìn)一步探討Fascin1 發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87 MG 購自American Type Culture Collection 公司。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為3 組:空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染neg-siRNA 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染Fascin1-siRNA 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞)。

1.2 主要試劑 DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素混合液(100 ×)購自HyClone公司;Lipofectamine 2000、Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基、針對(duì)Fascin1 的特異性siRNA 及陰性對(duì)照RNA 均購自Life Technologies;RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白酶抑制劑購自Roche 公司;小鼠抗Fascin1 單克隆抗體購自Abcam 公司;小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體購自生工上海股份有限公司;兔抗人AKT、p-AKT、p-STAT3、STAT 購自Cell Signaling 公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG 均購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;化學(xué)發(fā)光試劑購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;針對(duì)PI3K/AKT 通路的抑制劑LY294002 購自SIGMA-ALDRICH 公司;針對(duì)STAT3 通路的抑制劑JSI-124 購自Calbiochem公司;24-Well Cell Migration and Invasion 試劑盒購自cell biolabs。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87 MG 培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 鏈霉素雙抗的高糖DMEM 完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況，3～4 d 進(jìn)行一次傳代，取對(duì)數(shù)生長期、健康的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)將3 條靶向Fascin1 基因的特異性siRNA 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并篩選出對(duì)Fascin1 表達(dá)抑制最有效的一條。轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長期、健康的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)液懸浮后，以2 ×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中。Lipofectamine 2000 用Opti-MEM 預(yù)混后，靜置5 min，加入Opti-MEM 稀釋后的Fascin1-siRNA 和neg-siRNA 并混勻，室溫靜置20 min。將混合物按分組加入含膠質(zhì)瘤細(xì)胞的6 孔板中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 用1 ×PBS 充分洗滌細(xì)胞，再用含有1 ×蛋白酶抑制劑PIC 的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞抽提總蛋白。細(xì)胞裂解液用BCA 法檢測蛋白濃度。取30 μg 總蛋白與6 ×SDS-PAGE 上樣緩沖液混合后，在95℃的加熱儀上加熱5 min，再加至10%SDS-PAGE 膠上進(jìn)行電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。電轉(zhuǎn)后的PVDF 膜用含5%BSA 的TBST 封閉1 h，再分別加入1∶500～1∶2 000 稀釋后的相應(yīng)的一抗，將PVDF 膜置于搖床上，4℃孵育過夜。次日，經(jīng)TBST 充分洗滌后(10 min/次，共3 次)，分別加入相應(yīng)HRP 標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶5 000)，再將PVDF 膜置于搖床上，室溫孵育1 h。再次充分洗膜。最后用化學(xué)發(fā)光法顯色并用ECL 凝膠成像系統(tǒng)(ECL，USA)采集圖像。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.3.4 transwell 小室法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力 取轉(zhuǎn)染48 h 后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)液懸浮后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，鑒定細(xì)胞存活率為95%以上。根據(jù)transwell 說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照前述分組，以5 ×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于含有和不含有基質(zhì)膠的transwell 的上室中，分別用于測定膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力;在下室中加入含10% 胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于鋪板后12 h、24 h 對(duì)穿膜的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，并用酶標(biāo)儀測定其OD 值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 Western blot 技術(shù)圖像分析 顯像結(jié)果經(jīng)Quantityone 軟件進(jìn)行圖片分析、計(jì)算凈光密度值。并以Bio-Image Analysis System 進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以相對(duì)光密度值(Relative optical density，ROD)×面積(mm2)表示。蛋白的相對(duì)含量=(目的蛋白條帶ROD ×mm2)/(GAPDH 條帶ROD×mm2)。

1.4.2 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 用試劑盒自帶的細(xì)胞染色液(Cell stain solution)對(duì)穿膜的細(xì)胞進(jìn)行染色，再用試劑盒的脫色液(Extraction solution)進(jìn)行脫色，用酶標(biāo)儀檢測各組脫色液在560 nm 吸光度時(shí)的OD 值，并對(duì)OD 值的結(jié)果進(jìn)行比較分析。處理因素對(duì)細(xì)胞遷移/侵襲能力的抑制率=(對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD 值×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s 表示，組件比較采用t 檢驗(yàn)觀察其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 特異性siRNA 對(duì)Fascin1 蛋白表達(dá)抑制的驗(yàn)證 用Fascin1-siRNA 轉(zhuǎn)染U87 MG 細(xì)胞48 h 并提取細(xì)胞裂解液，用Fascin1 特異性抗體，通過免疫印跡檢測Fascin1 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，經(jīng)特異性siRNA 轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)Fascin1 水平顯著降低(圖1)，且以第3 條序列的抑制效果最佳，敲除Fascin1后其表達(dá)水平是未敲除細(xì)胞的(0.21 ±0.06)倍，P＜0.05，故選擇該條序列對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行Fascin1基因敲除，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Fascin1 低表達(dá)對(duì)U87 MG 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響 用Fascin1-siRNA 轉(zhuǎn)染U87 MG 細(xì)胞48 h 后，將胰酶消化并重懸后的細(xì)胞接種于含有或不含有基質(zhì)膠的上室中，檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果表明，相比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力降低了約(49 ±5.8)%及(46 ±5.4)%(P＜0.05)，侵襲能力降低了約(42±4.9)%和(43 ±4.8)%(P＜0.05)，見圖2，這說明Fascin1 能夠顯著促進(jìn)U87 MG 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.3 免疫印跡法檢測各組細(xì)胞內(nèi)p-AKT 和p-STAT3 的表達(dá)水平 取Fascin-siRNA 轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞裂解液，經(jīng)Western blot 法驗(yàn)證后顯示，F(xiàn)ascin1-siRNA 轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞相較于陰性對(duì)照或空白對(duì)照組的細(xì)胞，其AKT 蛋白和STAT3 蛋白的磷酸化均有明顯減少，分別是對(duì)照組的(0.32 ±0.08)倍和(0.07 ±0.03)倍，P＜0.05，見圖3。上述結(jié)果表明，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞Fascin1 蛋白的表達(dá)，會(huì)減弱相關(guān)通路蛋白AKT 和STAT3 的活化。

圖1 Western blot 法檢測RNA 干擾后Fascin1 的敲除率及條帶灰度值比Fig.1 Western blot analysis assess knockdown efficiency of Fascin1-siRNA

圖2 侵襲和轉(zhuǎn)移的U87 MG 細(xì)胞的OD 值檢測Fig.2 OD value of migratory and invasive U87 MG cells

圖3 Western blot 法檢測RNA 敲除Fascin1 后蛋白的表達(dá)變化Fig.3 Assessing expression of proteins post Fascin1-siRNA transfection by using Western blot analysis

圖4 抑制AKT 和STAT3 的磷酸化對(duì)U87 MG 細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響Fig.4 Impact on migration and invasion capacity of U87 MG cells by inhibiting phosphorylation of PI3K/AKT pathway and STAT3 pathway

2.4 抑制AKT 和STAT3 的磷酸化對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 將未處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)液中懸浮后接種于含有和不含有基質(zhì)膠的transwell 小室的上室中，培養(yǎng)4 h 后向?qū)嶒?yàn)組的上室中分別加入AKT 的抑制劑和STAT3 的抑制劑。20 小時(shí)后測定穿膜細(xì)胞的OD值，結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，抑制實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的AKT 和STAT3 磷酸化后，也顯著抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力［LY294002 抑制(75 ± 7.6)%，P＜0.05;JSI-124(61 ±5.9)%，P＜0.05］和侵襲能力［LY294002 抑制(63.5 ±6.1)%，P＜0.05;JSI-124(59 ±5.7)%，P＜0.05］(圖4)。由此表明，AKT 和STAT3 等相關(guān)信號(hào)通路分子的激活，會(huì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤之一，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高遷移、侵襲能力被認(rèn)為是影響治療和腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Fascin1 在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元的運(yùn)動(dòng)和突觸可塑性有重要作用［6-9］。近來研究表明，F(xiàn)ascin1 在多種腫瘤中異常高表達(dá)，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［16-18］。在膠質(zhì)瘤中，F(xiàn)ascin1 的表達(dá)較生理水平時(shí)升高，使絲狀偽足和板狀偽足形成增多，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［19］。本研究采用RNAi 技術(shù)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中Fascin1 的表達(dá)，在Fascin1 被抑制后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 MG 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均有顯著下降，與前述研究結(jié)果一致，表明膠質(zhì)瘤中Fascin1 的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍的腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移和浸潤。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤是多因子、多信號(hào)通絡(luò)參與的腫瘤進(jìn)展過程，其中，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT、JAK/STAT3 通路的異常激活可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞浸潤。Aye Aye Thant 在研究中指出，通過添加針對(duì)PI3K通路的抑制劑Wortmannin 和LY294002，可以使FN1蛋白引起的卵巢癌細(xì)胞株NOM1 的侵襲能力增強(qiáng)這一效應(yīng)得到逆轉(zhuǎn)［20］。此外，IL-6 可通過激活PI3K/AKT 和JAK/STAT3 通路的磷酸化，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，而添加了兩條通路的抑制劑后，則可逆轉(zhuǎn)IL-6 引起的效應(yīng)［21，22］。鑒于這兩種信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究觀察了抑制U87 MG 中Fascin1 的表達(dá)后，AKT 和STAT3 磷酸化水平的變化。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，F(xiàn)ascin1 表達(dá)抑制后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)AKT 和STAT3的磷酸化水平顯著降低，且單獨(dú)使用針對(duì)PI3K 通路的抑制劑LY294002 和針對(duì)STAT3 通路的抑制劑JSI-124 后，可觀察到AKT 和STAT3 激活減少，U87 MG 的浸潤、轉(zhuǎn)移能力顯著降低，表明PI3K/AKT 通路及STAT3 通路的激活在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，F(xiàn)ascin1 的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。本研究使用的針對(duì)Fascin1的特異性siRNA 能有效降低Fascin1 的表達(dá)，進(jìn)而通過抑制相關(guān)的PI3K/AKT 信號(hào)通路和STAT3 信號(hào)通路的激活，減弱了膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 MG 的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。Fascin1 在多種腫瘤中表達(dá)增高，且被認(rèn)為與膠質(zhì)瘤的分級(jí)正相關(guān)，以Fascin1 為靶標(biāo)的新療法可能成為治療Fascin1 高表達(dá)腫瘤的突破點(diǎn)。本研究揭示了Fascin1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞某些腫瘤特性的部分分子機(jī)制，然而體外細(xì)胞模型存在系統(tǒng)簡單、環(huán)境單一的缺陷，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比存在潛在差異。因此，對(duì)于Fascin1 發(fā)揮作用的更全面的分子機(jī)制，及Fascin1 在動(dòng)物模型中發(fā)揮的作用仍需進(jìn)一步研究。

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