芹菜素抑制脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)的分子機(jī)制①

吳 廣 符 平 周玉生 周潤(rùn)梅 (南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，衡陽(yáng) 421001)

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌中的重要組成部分，也是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的重要毒力因子［1］。革蘭陰性細(xì)菌感染后，可誘發(fā)機(jī)體固有免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)。在該過(guò)程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)證實(shí)，LPS 可迅速激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌多種促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6 以及NO 和巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1 等物質(zhì)，從而促進(jìn)機(jī)體清除病原體［2］。但如果炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷以及多器官功能衰竭［3，4］。傳統(tǒng)治療急性炎癥反應(yīng)主要采用固醇類和非甾體類藥物治療，但由于這些藥物副作用嚴(yán)重而使其應(yīng)用受限［5］，因此尋求新的抗炎輔助藥物對(duì)各類炎癥相關(guān)疾病的治療具有重要意義。

芹菜素(Apigenin，APG)是廣泛分布于水果、蔬菜(尤其是芹菜、大蒜和大白菜)中的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化等多種生物學(xué)作用［6］。此外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也表明APG 具有一定的抗炎效應(yīng)。如Huang 等［7］發(fā)現(xiàn)APG 可誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶，同時(shí)也能抑制尼古丁和LPS 誘導(dǎo)牙周韌帶細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子［7］。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，APG 可通過(guò)ERK 途徑抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α 和IL-1β［8］。但APG是否還存在其他的作用機(jī)制目前仍不明了。本研究旨在觀察APG 對(duì)LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen，APG、β-actin 多克隆抗體為Sigma-Aldrich 產(chǎn)品?？寡t素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)，Nrf2 以及增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體以及各類二抗購(gòu)自Santa Cruz。iNOS 多克隆抗體購(gòu)自BD Bioscience。HO-1 和Nrf2 siRNA 購(gòu)自Santa Cruz。PGE2 ELISA 試劑盒購(gòu)自R＆D System。磷酸酶、蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche，siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Qiagen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 RAW 264.7 細(xì)胞(ATCC)用含10%胎牛血清，100 U/ml 青霉素和100 mg/ml鏈霉素，4.5 mg/ml L-谷氨酰胺以及4.5 g/ml 的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。2～3 d 換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞加入不同濃度的APG 作用0～16 h，或隨后加入1 μg/ml LPS 刺激8 h。

1.3 細(xì)胞漿與細(xì)胞核蛋白提取 處理結(jié)束后的細(xì)胞用冰冷PBS(pH7.4)漂洗1 次，隨后加入100 μl裂解緩沖液A (10 mmol/L HEPES pH7.9，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTT，5 μmol/L 亮抑蛋白酶肽，2 μmol/L 胃酶抑素A，1 μmol/L 抑肽酶，20 μmol/L PMSF 和1 ×磷酸酶抑制劑混合物)，通過(guò)反復(fù)凍融以充分裂解細(xì)胞。隨后1 400 r/min 離心10 min，獲取上清再次離心15 min(1 400 r/min)后即為胞漿總蛋白。沉淀加入100 μl 緩沖液B(10 mmol/L Tris-HCl pH7.5，0.5% 脫氧膽酸鹽，1% NP-40，5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，5 μmol/L 亮抑蛋白酶肽，2 μmol/L 胃酶抑素A，1 μmol/L 抑肽酶，20 μmol/L PMSF)后，懸液于4℃震蕩30 min，1 400 r/min 離心20 min，上清即為核蛋白。

1.4 Western blot 采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl pH7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，1% SDS)裂解細(xì)胞，并用Bradford法于595 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白經(jīng)8%～10% SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗和HRP 標(biāo)記二抗孵育，ECL 顯影。

1.5 NOx 測(cè)定 亞硝酸和硝酸鹽(Nitrite and nitrate，NOx)含量的測(cè)定根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行［9］。細(xì)胞培養(yǎng)上清(100 μl)加入等體積Griess 試劑后，酶標(biāo)儀下獲取545 nm 波長(zhǎng)處的吸光度以間接測(cè)定NOx 的含量。

1.6 PGE2 測(cè)定 當(dāng)生長(zhǎng)于6 孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%視野時(shí)，棄培養(yǎng)基，并加入不同濃度的APG 作用1 h 后加入LPS 作用8 h。操作方法按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進(jìn)行。通過(guò)測(cè)定450 nm 處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分泌至細(xì)胞外的PGE2 含量。

1.7 MTT 實(shí)驗(yàn) 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。即，100 μl 細(xì)胞接種于96 孔板中培養(yǎng)12 h 后換成含5%胎牛血清和1 mg/ml 青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基。加入不同濃度的APG 后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。結(jié)束前4 h 各孔加入MTT 溶液20 μl(5 %)，棄上清，并加入200 μl 二甲基亞砜，充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A570)，并計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)室A 值)/對(duì)照組A 值×100%。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 約5 ×105細(xì)胞接種于60 mm 培養(yǎng)皿中18～24 h。隨后按照Qiagen 提供的操作步驟，將2 mg NF-κB 報(bào)告基因載體，100 nmol/L HO-1 siRNA 或?qū)φ誷iRNA 混合物孵育細(xì)胞。孵育4 h后，用PBS 漂洗細(xì)胞，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)用于下一步研究。

1.9 NF-κB 螢光素酶實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染有NF-κB 報(bào)告基因載體的細(xì)胞經(jīng)APG 和(或)LPS 處理完畢后，用冰冷PBS 漂洗2 遍，隨后用試劑盒提供的裂解液裂解細(xì)胞。NF-κB 螢光素酶活性按照Promega 公司試劑盒提供的方法進(jìn)行，采用TD-20/20 化學(xué)發(fā)光儀(Tumer Designs)測(cè)量其酶活性，所有數(shù)據(jù)設(shè)立3 個(gè)平行對(duì)照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s 表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APG 毒性作用分析 APG 作用于細(xì)胞的最佳濃度與不同的細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)。為了獲取最佳的作用濃度，采用MTT 實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度APG對(duì)RAW264.7 的毒性作用。圖1 結(jié)果顯示當(dāng)APG濃度超過(guò)30 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞的活性顯著降低，其IC50 值為(35.5 ±2.5)μmol/L，因此在隨后的研究過(guò)程中采用0～20 μmol/L 的APG 作為刺激濃度。

2.2 APG 對(duì)HO-1 表達(dá)的影響 0～20 μmol/LAPG作用RAW264.7 細(xì)胞16 h 后，可顯著誘導(dǎo)其表達(dá)HO-1，并且呈一定的劑量依賴性(圖2A)。隨后用20 μmol/L APG 作用細(xì)胞4 h 后即可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞表達(dá)HO-1，隨APG 作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HO-1 表達(dá)水平逐漸遞增，持續(xù)到12～16 h(圖2B)。

2.3 APG 誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)與p38 有關(guān) 采用20 μmol/L APG 作用RAW264.7 細(xì)胞0～6 h 后，Western blot 顯示2 h 后可明顯誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞中p38 磷酸化(圖3A)。而同時(shí)給予10～20 μmol/L p38 抑制劑SB203580 處理后，HO-1 的表達(dá)顯著降低(圖3B)。

2.4 APG 誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)依賴Nrf2 激活 RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)不同濃度APG 作用4 h 后，隨著濃度的增加，細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2 含量逐漸降低。相應(yīng)的，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 的含量逐漸增高(圖4A)。而胞漿內(nèi)參β-actin 和胞核內(nèi)參PCNA 保持恒定。此外，采用siRNA 干擾沉默Nrf2 表達(dá)后，HO-1 蛋白表達(dá)量降低(圖4B)。

圖1 不同濃度APG 對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活性的影響Fig.1 Different concentration of APG on cell viability of RAW264.7 cells

圖2 APG 誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞表達(dá)HO-1Fig.2 APG induces RAW 264.7 cells expression of HO-1

2.5 干擾HO-1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)APG 抑制NOx、PGE2、COX-2 和iNOS 的表達(dá) LPS 作用RAW264.7 細(xì)胞后8 h 后，可誘導(dǎo)其分泌NOx 和PGE2(圖5A)，并表達(dá)COX-2 和iNOS(圖5B)。而經(jīng)20 μmol/L APG 預(yù)處理4 h 后，可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的NOx 和PGE2產(chǎn)生以及COX-2 和iNOS 表達(dá)。RAW264.7 經(jīng)siRNA 沉默HO-1 表達(dá)后，與處理前相比，NOx、PGE2產(chǎn)生以及COX-2 和iNOS 表達(dá)明顯增高。

圖3 APG 經(jīng)p38 誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞表達(dá)HO-1Fig.3 APG induces RAW 264.7 cells expression of HO-1 via p38

圖4 APG 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞表達(dá)HO-1 與激活Nrf2 有關(guān)Fig.4 APG induces RAW264.7 cells expression of HO-1 was mediated by Nrf2 activation

圖5 干擾HO-1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)APG 抑制NOx 和PGE2 產(chǎn)生以及COX-2 和iNOS 的表達(dá)Fig.5 Silencing of HO-1 reverses inhibitory effect of APG on NOx and PGE2 production，and COX-2 and iNOS expression

圖6 APG 抑制LPS 激活RAW264.7 細(xì)胞中NF-κBFig.6 APG inhibits LPS-activated NF-κB in RAW 264.7 cells

2.6 APG 抑制NF-κB 激活 螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，LPS 可顯著上調(diào)NF-κB 的活性，而不同濃度APG 預(yù)處理4 h 可降低其活性，并呈一定的劑量依賴性(圖6A)。此外，LPS 也能促進(jìn)IκB 磷酸化，而APG 處理后，磷酸化IκB 含量顯著降低，見(jiàn)圖6B。

3 討論

巨噬細(xì)胞在各種病原微生物引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。各種細(xì)菌和病毒均可活化巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分泌一系列炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)。盡管在急性期這些物質(zhì)對(duì)清除病原體感染、維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)方面具有積極作用，但巨噬細(xì)胞的持續(xù)活化也是引起各種病理性損傷的重要原因。因此采用藥物干預(yù)炎癥反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)度，是有效預(yù)防各類病理?yè)p傷的重要途徑。先前研究發(fā)現(xiàn)，APG 可抑制LPS 誘導(dǎo)J774.2 細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 和IL-1β［10］，但APG是否還具有其他的抗炎機(jī)制目前仍不清楚。在本研究當(dāng)中，我們對(duì)一些炎癥相關(guān)介質(zhì)進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APG 不僅能下調(diào)iNOS 的表達(dá)水平，也能降低NOx 的水平，同時(shí)也能抑制COX-2 的表達(dá)并下調(diào)PGE2 的分泌。通過(guò)采用抑制劑以及RNA 干擾和報(bào)告基因等方法，最終證實(shí)APG 對(duì)這些炎癥介質(zhì)的抑制效應(yīng)很大程度上是通過(guò)上調(diào)HO-1、抑制NF-κB的活性而實(shí)現(xiàn)的。

HO-1 是催化血紅素降解為膽紅素、Fe2+和CO的限速酶，又稱為熱休克蛋白32。HO-1 為誘導(dǎo)型，多種病理生理狀態(tài)可誘導(dǎo)其表達(dá)，如LPS、磷壁酸、肽聚糖以及促炎細(xì)胞因子等［11］。Stuart 等［12］研究表明，LPS 通過(guò)上調(diào)HO-1 的表達(dá)，從而抑制單核細(xì)胞系THP-1 過(guò)度分泌細(xì)胞因子。此外，在動(dòng)物模型中，誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)可調(diào)節(jié)流感病毒引起的免疫反應(yīng)［13］。而HO-1 基因敲出動(dòng)物對(duì)氧化應(yīng)激以及多器官功能衰竭的敏感性增加［14］，因此HO-1 的表達(dá)可能是宿主細(xì)胞免受氧化應(yīng)激與炎癥損傷的一種獲得性保護(hù)機(jī)制。一般認(rèn)為，HO-1 的表達(dá)受Nrf2 的調(diào)控，此外，PKC、PI3K/Akt 和MAPKs 也參與了HO-1的表達(dá)［15］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)p38 抑制劑SB203580 可顯著抑制APG 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞表達(dá)HO-1，而JNK 抑制劑SP600125，ERK1/2 抑制劑PD98059 均不能有效抑制APG 誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)(結(jié)果未顯示)，這表明p38 參與了HO-1 的表達(dá)，與Biederbick 等的結(jié)果類似［16］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)p38 磷酸化后可下調(diào)HO-1 的表達(dá)，這表明p38 在調(diào)控HO-1 表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮雙重作用［17］。還有研究顯示p38 和Nrf2 參與了內(nèi)皮細(xì)胞中HO-1 的表達(dá)［18］，這表明p38 和Nrf2 參與調(diào)控HO-1 并不局限于巨噬細(xì)胞。先前雖然有大量的研究表明APG 對(duì)炎癥介質(zhì)的分泌具有抑制作用，但尚未有HO-1 參與APG調(diào)控炎癥的相關(guān)報(bào)道。如Zhang［19］發(fā)現(xiàn)APG 能下調(diào)LPS 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)COX-2 和iNOS，并抑制其凋亡。Jeong［20］的研究發(fā)現(xiàn)APG 可抑制LPS 誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞表達(dá)iNOS、COX-2 以及分泌PGE2，其機(jī)制與抑制PI3K 信號(hào)通路以及蛋白激酶C 的活性有關(guān)。此外，Li 等［21］研究也發(fā)現(xiàn)APG 不僅能抑制內(nèi)毒素肺損傷大鼠中炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，同時(shí)也能抑制MAPKs 和NF-κB 的激活。為了進(jìn)一步明確HO-1 是否參與APG 調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達(dá)與分泌，本研究隨后通過(guò)采用特異性siRNA 干擾HO-1的表達(dá)后顯示，APG 對(duì)NOx、PGE2 以及iNOS 和COX-2 表達(dá)的抑制作用隨之降低，這表明APG 對(duì)這些炎癥介質(zhì)的調(diào)控是通過(guò)上調(diào)HO-1 而實(shí)現(xiàn)的。HO-1 發(fā)揮對(duì)炎癥的保護(hù)作用仍未完全明了。主要可能與其催化產(chǎn)物CO、膽紅素和Fe2+有關(guān)。CO 是重要的氣體信號(hào)分子，能通過(guò)自分泌或旁分泌方式誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生第二信使cGMP 而發(fā)揮生理功能。膽紅素在體內(nèi)是重要的抗氧化劑，不但可以直接清除氧自由基，而且還可以減輕炎癥性細(xì)胞的聚集。Fe2+可以誘導(dǎo)鐵蛋白的合成，后者可減少細(xì)胞內(nèi)游離鐵的蓄積而發(fā)揮保護(hù)作用，還可以拮抗ROS 對(duì)細(xì)胞的毒性作用［22］。

本研究的另一重要發(fā)現(xiàn)是APG 可抑制NF-κB的活性。NF-κB 是參與眾多炎癥因子和炎癥介質(zhì)的主要核轉(zhuǎn)錄因子。生理?xiàng)l件下，NF-κB 中的p65 亞基和抑制因子IκB 結(jié)合而位于細(xì)胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到各種外源性因素作用后，可誘導(dǎo)IκB 磷酸化而降解，p65 亞基隨后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，與靶基因啟動(dòng)子上的結(jié)合原件結(jié)合而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，APG可在小鼠模型中抑制NF-κB p65 亞基中第536 位絲氨酸磷酸化而抑制其激活［23］。本研究通過(guò)報(bào)告基因結(jié)果也顯示APG 可抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)APG 能以劑量依賴性方式抑制抑制IκB 磷酸化，最終抑制NF-κB 的活性?？傊?，本研究證實(shí)APG 的抗炎作用與其誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)激活p38 和Nrf2 而實(shí)現(xiàn)的。除了HO-1直接對(duì)iNOS 和COX-2 的負(fù)調(diào)控作用外，APG 抑制NF-κB 的激活也可能是其重要的抗炎機(jī)制。

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