幽門螺桿菌作用巨噬細胞后誘導的炎癥反應研究①

王建軍 王澤友 姚永良 吳建紅 李光新 (江蘇大學附屬昆山醫(yī)院 檢驗科，昆山 215300)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性活動性胃炎、胃潰瘍以及胃癌的主要病因，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究會將幽門螺桿菌定為Ⅰ級或明確的人類致癌因子［1］。據(jù)我國衛(wèi)生部門統(tǒng)計，我國幽門螺桿菌感染率高達到53%以上，感染者超過6 億，同時流行病學調(diào)查表明胃癌發(fā)生率與幽門螺桿菌的感染率呈正相關。

幽門螺桿菌感染入侵機體后促進胃黏膜中巨噬細胞大量增殖，增強胃黏膜局部炎癥因子如白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、IL-8、IL-18 的表達，引起胃黏膜局部強烈的炎性反應和免疫應答，并在這些細胞因子的募集下誘導巨噬細胞遷移并浸潤到胃黏膜局部組織從而清除幽門螺桿菌［2，3］。巨噬細胞是胃黏膜中防御幽門螺桿菌的重要免疫細胞，它主要通過分泌腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1、IL-10、IL-12 等多種細胞因子產(chǎn)生炎癥反應，并與活性氧、活性氮等共同作用清除幽門螺桿菌［4，5］。本文主要通過幽門螺桿菌對巨噬細胞的感染來研究巨噬細胞的炎癥反應及其對宿主細胞的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人THP-1 細胞系、幽門螺桿菌菌株購自中科院上海生科院細胞庫。RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone 生物技術公司。IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物技術公司;Annexin-V FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海前塵生物技術公司;預染蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)marker、Cocktail 蛋白酶抑制劑及蛋白質(zhì)提取試劑盒均購自Fermantas 生物技術公司。兔抗人COX2、NOS2 抗體、鼠抗人GAPDH 抗體、羊抗兔IgG 及羊抗鼠IgG 抗體均購自上海義森生物科技有限公司。佛波酯(12-鄰-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)及DMSO 購自德國默克生物技術公司。

1.2 幽門螺桿菌培養(yǎng) 幽門螺桿菌菌株接種于以布氏瓊脂培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基的，含6%脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素(三甲氧芐氨嘧啶5 mg/L、萬古霉素6 mg/L、兩性霉素2 mg/L)的血平板上，于10%CO2，5%O2及85%N2混合氣體培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。細胞刮輕輕刮下幽門螺桿菌后以無菌生理鹽水震蕩1 min，稀釋使其濁度與麥氏0.5 號管濁度一致(即菌液濃度約為1.5 ×108個/ml)，計算得出原菌液濃度(1.5 ×109ml-1)。

1.3 細胞培養(yǎng) THP-1 細胞于含10 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)48 h 后，0.1 mmol/L PMA 誘導THP-1 細胞24 h，使其分化形成巨噬細胞。巨噬細胞隨機分為三組即空白對照組、LPS 刺激組(50 ng/ml)、幽門螺桿菌處理組(細菌∶細胞=10∶1)。

1.4 ELISA 檢測細胞因子 巨噬細胞經(jīng)LPS，幽門螺桿菌處理24 h 后，4℃，1 000 r/min 離心5 min，收集各處理組的細胞培養(yǎng)上清，ELISA 試劑盒分別檢測細胞上清中IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 的含量(按照試劑盒說明操作)。根據(jù)標準品的濃度與OD 值繪制標準曲線，從而計算待測樣品中IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 的濃度。

1.5 Western blot 蛋白質(zhì)提取試劑盒提取LPS，幽門螺桿菌處理的巨噬細胞總蛋白，Bradford 法測定總蛋白濃度。配制10%SDS-PGAE 電泳膠，將變性后的蛋白質(zhì)按50 μg 的蛋白總量進行垂直電泳，然后通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，兔抗人COX2 抗體、兔抗人NOS2 抗體、鼠抗人GAPDH 抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的二抗進行免疫反應，最后將PVDF 膜于凝膠成像儀中曝光顯影。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡水平 收集LPS、幽門螺桿菌刺激后的巨噬細胞106個，PBS(含2 g/L BSA)輕輕洗滌2 次;然后分別加入10 μl 的FITC 標記的Annexin-V 抗體及PE 試劑，重懸細胞后室溫避光孵育30 min。PBS(含2 g/L BSA)洗滌細胞2 次，0.4 ml PBS(含2 g/L BSA)重懸細胞后，流式細胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5軟件進行處理分析，兩組間比較采用t 檢驗，多組間兩兩比較采用Scheffe 法，P＜ 0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細胞炎癥因子分析 ELISA 方法檢測LPS、幽門螺桿菌刺激巨噬細胞后，細胞上清中IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 的含量，獨立重復八次實驗，Graph-Pad Prism 5 軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果表明幽門螺桿菌處理巨噬細胞后，誘導巨噬細胞分泌IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 細胞因子顯著增多，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖1)。

圖1 ELISA 方法檢測LPS、Hp 刺激巨噬細胞后細胞上清中細胞因子含量變化(n=8)Fig.1 Cytokines in cell supernatant of macrophages stimulated with LPS or Hp for 24 h were detected by ELISA method(n=8)

圖2 Western blot 分析LPS、Hp 處理巨噬細胞后細胞中NOS2 與COX2 的表達水平(n=3)Fig.2 Expression of NOS2 and COX2 in macrophages treated with LPS or Hp was analyzed by Western blot(n=3)

圖3 流式細胞術檢測LPS、Hp 處理巨噬細胞后的細胞凋亡變化(n=3)Fig.3 Apoptosis of macrophages treated with LPS，Hp or medium was detected by flow cytometry(n=3)

2.2 Western blot 分析NOS2 與COX2 蛋白表達 幽門螺桿菌、LPS 及空白對照物Medium 分別處理巨噬細胞24 h 后，Western blot 分析細胞炎癥關鍵酶COX2 及NOS2 的表達水平(圖2)，Image J 掃描其灰度并經(jīng)GAPDH 灰度值校正后，GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。實驗表明LPS 刺激巨噬細胞后NOS2、COX2 表達上調(diào)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而幽門螺桿菌處理巨噬細胞后，NOS2、COX2蛋白表達顯著上調(diào)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 流式細胞術分析巨噬細胞經(jīng)幽門螺桿菌處理后的細胞凋亡 LPS、幽門螺桿菌及空白對照物Medium 分別刺激巨噬細胞24 h 后，收集各處理組巨噬細胞并以FITC 標記的Annexin-V 抗體、PE 試劑孵育后，流式細胞儀檢測各組巨噬細胞凋亡情況(圖3)，GraphPad Prism 5 統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果表明幽門螺桿菌作用巨噬細胞后，巨噬細胞凋亡數(shù)量顯著增多，有統(tǒng)計學意義(P＜0.03)。

3 討論

幽門螺桿菌感染機體后，機體固有免疫是抵御幽門螺桿菌感染的天然屏障，胃組織中的巨噬細胞、樹突狀細胞等固有免疫細胞通過分泌IL-1、IL-12、IL-18 等細胞因子，激活免疫細胞并分泌炎癥介質(zhì)，發(fā)揮抗感染作用。胃組織中的巨噬細胞被幽門螺桿菌感染后，巨噬細胞在炎癥組織局部浸潤、增生、激活并分泌TNF-α、IL-1、IL-8 等細胞因子，活化淋巴細胞及殺傷入侵微生物。同時TNF-α 協(xié)同誘導巨噬細胞產(chǎn)生NO，誘導DNA 的損傷導致宿主細胞的凋亡［6］。細胞因子IL-8、IL-10、IL-23 等具有顯著的細胞趨化作用，并能誘導中性粒細胞變形、脫顆粒和溶酶體釋放反應，釋放出的蛋白酶能直接損害細胞，參與局部炎癥反應。白細胞介素在幽門螺桿菌感染相關性疾病的局部炎癥及胃黏膜損傷中起重要作用，其表達水平與幽門螺桿菌導致的胃炎活動度、炎癥程度及幽門螺桿菌密度均顯著相關。本研究體外實驗發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌作用巨噬細胞后能夠促進巨噬細胞細胞因子IL-10、IL-23、TNF-α 及IL-8 的分泌，從而增強巨噬細胞對幽門螺桿菌的殺傷作用。

一氧化氮合酶-2(Nitric oxide synthase-2，NOS2)可促進環(huán)氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX2)的激活，同時細胞炎癥反應促進NOS2 和COX2 表達水平增強從而協(xié)同促進人結(jié)腸癌的發(fā)生［7］。幽門螺桿菌感染胃組織細胞后通過炎癥細胞釋放細胞因子間接誘導胃黏膜炎癥細胞表達COX2，再通過旁分泌機制和信號轉(zhuǎn)導引起上皮細胞表達COX2［8］。此外，幽門螺桿菌感染及其毒素可能直接誘導COX2 表達，并通過啟動ERKI/ERK2 磷酸化等級聯(lián)事件引起NF-κB 的激活、促進COX2 和NOS2 表達增加［9］。本研究Western blot 結(jié)果表明，幽門螺桿菌作用巨噬細胞后感染促進細胞COX2 與NOS2 蛋白表達增強，進而調(diào)控巨噬細胞炎癥反應及細胞呼吸爆炸反應對幽門螺桿菌的侵襲做出免疫反應。

幽門螺桿菌感染巨噬細胞后在巨噬細胞內(nèi)可產(chǎn)生自噬小體(Autophagosome)，逃避巨噬細胞對其殺傷，并且幽門螺桿菌能在巨噬細胞自噬小體內(nèi)持續(xù)增殖，導致巨噬細胞的凋亡并感染周圍巨噬細胞加重感染［10］，而我們實驗發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌長時間作用巨噬細胞可導致巨噬細胞的大量凋亡。本文主要分別從炎性因子分泌、炎癥反應關鍵酶表達等方面初步研究幽門螺桿菌感染巨噬細胞后引起的炎癥反應，但具體的炎癥機制有待進一步深入研究。

［1］Zhang C，Yamada N，Wu YL，et al.Helicobacter pylori infection，glandular atrophy and intestinal metaplasia in superficial gastritis，gastric erosion，erosive gastritis，gastric ulcer and early gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2005，11(6):791-796.

［2］Dzierzanowska-Fangrat K，Michalkiewicz J，Cielecka-Kuszyk J，et al.Enhancedgastric IL-18 mRNA expression in Helicobacter pylori infected children is associated with macrophage infiltration，IL-8，and IL-1 beta mRNA expression［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2008，20(4):314-319.

［3］Schumacher MA，Donnelly JM，Engevik AC，et al.Gasmc Sonic Hedgehog acts as a macrophage chemoattraetant during the immune response to Helicobacter plyori［J］.Gastroenterology，2012，142:1150-1159.

［4］Slomiany BL，Slomiany A.Modulation of gastric mucosal inflammatory responses to Helicobacter pylori via ghrelin-induced protein kinase Cδ tyrosine phosphorylation ［J］.Inflammopha-rmacology，2014，22(4):251-262.

［5］Kumar PS，Brandt S，Madassery J，et al.Induction of TLR-2 and TLR-5 expression by Helicobacter pylori switches cagPAI-dependent signalling leading to the secretion of IL-8 and TNF-α ［J］.PLoS One，2011，6(5):e19614.

［6］Tang CL，Hao B，Zhang GX，et al.Helicobacter pylori tumor necrosis factor-α inducing protein promotes cytokine expression via nuclear factor-κB ［J］.World J Gastroenterol，2013，19 (3):399-403.

［7］Chaturvedi R，Asim M，Barry DP，et al.Spermine oxidase is a regulator of macrophage host response to Helicobacter pylori:enhancement of antimicrobial nitric oxide generation by depletion of spermine［J］.Amino Acids，2014，46(3):531-542.

［8］Xiong H，Du W，Sun TT，et al.A positive feedback loop between STAT3 and cyclooxygenase-2 gene may contribute to Helicobacter pylori-associated human gastric tumorigenesis［J］.Int J Cancer，2014，134(9):2030-2040.

［9］Sierra JC，Hobbs S，Chaturvedi R，et al.Induction of COX-2 expression by Helicobacter pylori is mediated by activation of epidermal growth factor receptor in gastric epithelial cells ［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，305(2):196-203.

［10］Wang YH，Wu JJ，Lei HY.The Autophagic Induction in Helicobacter pylori-Infected Macrophage［J］.Exp Biol Med，2009，234(2):171-180.