N 端前腦鈉肽穩(wěn)定保存體系的優(yōu)化①

王 翠 王云龍 明 亮 鄭配國(guó) 謝南昌 李玉林 王繼創(chuàng)

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科，鄭州 450052)

心衰是多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病過程非常復(fù)雜［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn):B 型腦鈉肽(BNP)或其非活性的N 末端前腦鈉肽(NT-proBNP)是心衰時(shí)較好的心臟標(biāo)志物［2］，它在血液中的含量能反映心室容積擴(kuò)大、心室超負(fù)荷和心臟功能損傷及損傷程度［3-7］。與BNP 相比，NTproBNP 因其半衰期長(zhǎng)(120 min)、心衰時(shí)大幅度升高而更有利于臨床疾病診斷［6，8，9］。因此，檢測(cè)血液中的NT-proBNP 含量，對(duì)于無癥狀心衰的早期診斷、急性心衰的嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)心衰病程的發(fā)展和療效觀察及鑒別心源性和非心源性的呼吸困難均具有重要意義。

診斷試劑盒的研發(fā)為血清中NT-proBNP 的定量檢測(cè)提供了重要的檢測(cè)手段，而試劑盒中質(zhì)控品的質(zhì)量是保證NT-proBNP 定量檢測(cè)準(zhǔn)確與否的前提條件。目前檢測(cè)試劑中常用的質(zhì)控品主要有干粉和液體兩種，干粉質(zhì)控品制備是一個(gè)非常復(fù)雜的物理化學(xué)變化過程，在凍干過程中，電解質(zhì)濃度的改變、溶液pH 值的變化以及生產(chǎn)和貯存過程中的溫度變化都會(huì)對(duì)制備的質(zhì)控品質(zhì)量產(chǎn)生影響，另外，其穩(wěn)定性亦受溶劑質(zhì)量、溶劑量、保存溫度及時(shí)間等多種因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果質(zhì)控變異系數(shù)增大，成為檢測(cè)試劑盒研制工作中的一個(gè)難題［10］。近年來使用的液體質(zhì)控品，避免了凍干、復(fù)溶及分裝等步驟，能有效克服以上各環(huán)節(jié)造成的誤差，因此從經(jīng)濟(jì)和使用便捷性方面考慮，市場(chǎng)更青睞可長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的液體質(zhì)控品。但液體質(zhì)控品在實(shí)際應(yīng)用中存在容易降解的現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測(cè)值出現(xiàn)偏差，嚴(yán)重影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，如何延長(zhǎng)液體質(zhì)控品的保存時(shí)間是目前研究的熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)通過ELISA 法對(duì)NT-proBNP 檢測(cè)試劑中NT-proBNP 的保存條件進(jìn)行深入的研究，旨在尋找一種簡(jiǎn)便、有效的NT-proBNP 血清質(zhì)控品保存方法。

1 材料與方法

1.1 材料 NT-proBNP 定值血清P1 為3 000 pg/ml、P2 為200 pg/ml、NT-proBNP 低值血清P3 ＜20 pg/ml:由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，為無溶血、常規(guī)傳染病檢測(cè)陰性的樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NT-proBNP 樣品的前處理 NT-proBNP 血清于60℃滅活1 h 后，5 000 r/min 離心30 min 去除雜質(zhì)，采用0.22 μm 的無菌濾器過濾至15 ml 無菌管中，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取滅菌離心管，將定值血清P1 用試驗(yàn)中采用的不同成分的保存液分別稀釋至200 pg/ml 或用P3稀釋至200 pg/ml(P4)待用。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用雙抗體夾心ELISA 法定量檢測(cè)NT-proBNP 含量。

1.2.3 基礎(chǔ)緩沖體系的確定 以去離子水、pH6.8、7.2、8.0、8.8 的Tris 緩沖液，pH6.4、6.8、7.2、7.8 的PB 和PBS 緩沖液共13 種溶液作為基礎(chǔ)緩沖體系的候選緩沖液，以NT-proBNP 血清P4 作為試驗(yàn)結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)。分別用候選基礎(chǔ)緩沖液稀釋10%小牛血清作為NT-proBNP 保存液稀釋P1 至200 pg/ml 進(jìn)行酶免反應(yīng)，每組實(shí)驗(yàn)至少有3 個(gè)重復(fù)。以接近血清P4 檢測(cè)結(jié)果(OD 值)的緩沖體系確定為NT-proBNP 保存試驗(yàn)中的基礎(chǔ)緩沖體系。

1.2.4 保存液成分的確定

1.2.4.1 防腐劑的選擇 選擇已優(yōu)化的基礎(chǔ)緩沖體系進(jìn)行防腐劑的選擇實(shí)驗(yàn)，分別用10%小牛血清、10%小牛血清添加1/1 000 Proclin300 作為保存液稀釋P1 至200 pg/ml 進(jìn)行NT-proBNP 血清保存試驗(yàn)。樣品分為3 份，分別置于-20℃、4℃、37℃。4℃、-20℃中保存樣品7 d，37℃保存樣品每天取樣至第4 天，已取樣樣品置于-20℃中保存，至第7 天后統(tǒng)一檢測(cè)樣本OD 值的變化，以O(shè)D 值降低相對(duì)較緩慢的條件確定為優(yōu)選的保存液成分。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4.2 抗生素的選擇 選擇已確定的基礎(chǔ)緩沖體系、小牛血清及防腐劑進(jìn)行抗生素的選擇實(shí)驗(yàn)。分別用添加青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)和青霉素(100 U/ml)三組實(shí)驗(yàn)作為保存液稀釋P1 至200 pg/ml 進(jìn)行NTproBNP 血清保存試驗(yàn)。樣品分為3 份，分別置于-20℃、4℃、37℃。4℃、-20℃中保存樣品7 d，37℃保存樣品每天取樣至第5 天，已取樣樣品置于-20℃中保存，至第7 天后統(tǒng)一檢測(cè)樣本OD 值的變化，以O(shè)D 值降低相對(duì)較緩慢的條件確定為優(yōu)選的保存液成分。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 最佳保存液組分的確定 根據(jù)上述試驗(yàn)確定的NT-proBNP 保存液成分設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表L9(34)(表1)，分別用各組保存液稀釋P1 至200 pg/ml 進(jìn)行試驗(yàn)，樣品于37℃保存8 d，從第3 天開始每天取樣至第8 天，-20℃保存，至第8 天后統(tǒng)一檢測(cè)樣本OD 值的變化，以O(shè)D 值降低相對(duì)較緩慢的條件為最佳的保存液組分。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照優(yōu)選的最佳保存液稀釋P1獲得5份NT-proBNP參考品(P5:2 5 0 pg/ml、P6:200 pg/ml、P7:150 pg/ml、P8:100 pg/ml、P9:50 pg/ml)，于-20℃、4℃、37℃條件下進(jìn)行為期7 d 的保存實(shí)驗(yàn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并標(biāo)定NT-proBNP 定值血清P2，以標(biāo)定的P2 結(jié)果判斷線性參考品保存情況，用P4 標(biāo)本在37℃中NT-proBNP 的降解情況為對(duì)照。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Tab.1 Factors and levels in L9(34)orthogonal test

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。批內(nèi)組間采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)緩沖體系的確定 按照設(shè)計(jì)的13 種候選基礎(chǔ)緩沖體系進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，結(jié)果如表2:不同的緩沖體系及其pH 值均影響NT-proBNP 的檢測(cè)。其中，去離子水反應(yīng)體系中標(biāo)本(200 pg/ml)檢測(cè)OD均值為0.391;pH6.4 的PB 緩沖液中標(biāo)本的檢測(cè)OD 均值為0.681;pH6.8～8.0 的Tris 緩沖液中標(biāo)本的檢測(cè)OD 均值在0.6 左右;pH7.2 的PBS 緩沖液中標(biāo)本的檢測(cè)OD 均值為0.73，與P4 血清的檢測(cè)結(jié)果(OD=0.733)無顯著差異(P ＞0.05)，因此，本試驗(yàn)基礎(chǔ)緩沖體系選擇0.02 mol/L pH7.2 的PBS緩沖液。

2.2 保存體系成分的確定

2.2.1 防腐劑的確定 選擇已確定的基礎(chǔ)緩沖體系進(jìn)行37℃保存實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3:選用10%小牛血清作為NT-proBNP 保存液時(shí)，NT-proBNP 樣本于37℃保存1 d 檢測(cè)OD 值已經(jīng)開始下降(P ＜0.01)。選擇10%小牛血清中添加防腐劑Proclin300 作為NT-proBNP 保存液時(shí)，NT-proBNP 樣本于37℃保存2 d 檢測(cè)OD 值開始下降(P ＜0.05)。NT-proBNP 在兩組保存液中于4℃和-20℃保存7 d 后檢測(cè)OD值均無明顯變化(P ＞0.05)。因此，試驗(yàn)選擇在NT-proBNP 保存液中添加防腐劑Proclin300 來延長(zhǎng)NT-proBNP 樣本保存時(shí)間。

2.2.2 抗生素的選擇 選擇已確定的基礎(chǔ)緩沖體系、10%小牛血清及1/1 000 Proclin300 進(jìn)行抗生素選擇實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4:保存液中添加100 U/ml 青霉素或100 U/ml 鏈霉素，NT-proBNP 樣本于37℃保存第3 天檢測(cè)OD 值開始下降(P ＜0.01)。保存液中同時(shí)添加100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素，NT-proBNP 樣本于37℃保存第4 天檢測(cè)OD 值開始下降(P ＜0.05)。但NT-proBNP 在4℃和-20℃保存7 d 后其OD 值均無明顯變化(P ＞0.05)。因此，試驗(yàn)選擇青霉素和鏈霉素作為NT-proBNP 保存液中添加的抗生素。

2.3 最佳保存液組分的確定 正交試驗(yàn)結(jié)果如圖1:NT-proBNP 在第8 組及第9 組保存體系中，于37℃中保存7 d 降解不明顯(P ＞0.05)，能夠滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)室存放液體血清制品的需求?？紤]到經(jīng)濟(jì)因素，本試驗(yàn)選擇第8 組:20%小牛血清添加1/1 000 Proclin300、120 U/ml 青霉素及80 U/ml 鏈霉素作為NT-proBNP 血清的保存液。

表2 不同緩沖體系保存NT-proBNP 的ELISA 檢測(cè)結(jié)果(n=3)Tab.2 Different basic buffer systems in comparison with normal human serum(n=3)

表3 防腐劑對(duì)NT-proBNP 保存的影響(n=3)Tab.3 Influence of NT-proBNP level by using Proclin300(n=3)

2.4 參考品保存驗(yàn)證試驗(yàn) 正常人血清稀釋的樣本P4 進(jìn)行的保存對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果如表5:血清P4 在37℃中保存1 d 即降解(P=0.05)。采用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的保存液保存NT-proBNP 參考品，分別在37℃、4℃和-20℃中保存7 d 后通過ELISA 檢測(cè)結(jié)果見表6:選用保存的參考品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2＞0.99)，用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定一份定值血清P2 及回測(cè)P5、P6、P7、P8、P9，結(jié)果顯示:37℃、4℃和-20℃中保存7 d 的NT-proBNP參考品檢測(cè)結(jié)果無顯著差異(P ＞0.05)。37℃保存的參考品標(biāo)定P2 中NT-proBNP 的含量比4℃中保存的參考品標(biāo)定P2 結(jié)果僅降低了1.3%，該保存液保存的NT-proBNP 參考品基本滿足檢測(cè)試劑盒的保存要求。

圖1 不同保存組分檢測(cè)結(jié)果(37℃)(n=3)Fig.1 NT-proBNP level under different storage conditions at 37℃(n=3)

表4 抗生素成分的確定(n=3)Tab.4 Influence of NT-proBNP level by using different antibiotics(n=3)

表5 P4 檢測(cè)結(jié)果(n=3)Tab.5 Results of product P4(n=3)

表6 線性參考品驗(yàn)證結(jié)果(n=3)Tab.6 Validation results of standard linear products(n=3)

3 討論

目前檢測(cè)試劑常用液體質(zhì)控品的來源主要有基因工程表達(dá)蛋白及血液制品，因血液制品中的檢測(cè)蛋白或抗體為天然構(gòu)象，在檢測(cè)過程中能更準(zhǔn)確地反映檢測(cè)結(jié)果而受到人們的青睞。但血液質(zhì)控品成分較復(fù)雜，在保存過程中易受多種蛋白質(zhì)、離子、pH值、化學(xué)反應(yīng)、微生物活動(dòng)及自身穩(wěn)定性等因素的影響，隨時(shí)間的延長(zhǎng)其濃度必然發(fā)生變化。另外，血液質(zhì)控品的穩(wěn)定性與保存時(shí)間和溫度也有關(guān)［11］:一般情況下，血清(漿)標(biāo)本在22℃～24℃可以保存2 h，2℃～4℃可以保存4 h，-20℃可以保存2 周，-70℃可以保存6 個(gè)月。羅氏研發(fā)的NT-proBNP 診斷試劑［12］中顯示NT-proBNP 血清能夠在20℃～25℃穩(wěn)定3 d，在2℃～8℃穩(wěn)定6 d，在-24℃穩(wěn)定24個(gè)月。

為了提高NT-proBNP 血清質(zhì)控品的保存時(shí)間，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NT-proBNP 血清保存基礎(chǔ)緩沖液選擇緩沖體系比選擇去離子水更有利于抗原抗體的結(jié)合，這主要是因?yàn)榭乖c抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中須有離子參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊的凝集或沉淀。在PBS、PB 和Tris 三種緩沖體系進(jìn)行的NT-proBNP 高值血清稀釋對(duì)比試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):選擇0.02 mol/L pH7.2 的PBS 緩沖液體系較0.02 mol/L pH6.4～7.8 的PB 和0.02 mol/L pH6.8～8.8 的Tris 更接近正常人血清稀釋的檢測(cè)結(jié)果，表明選用0.02 mol/L pH7.2 的PBS 作為基礎(chǔ)緩沖體系較接近血清自身的微環(huán)境，有利于抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)。相比較PB緩沖液，PBS 中的K+及不同的離子強(qiáng)度能夠促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)，而Tris 緩沖液因其緩沖能力較強(qiáng)，在pH6.8～8.0 時(shí)檢測(cè)結(jié)果相對(duì)較穩(wěn)定，但因Tris 緩沖液有可能影響生物活性，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低，檢測(cè)結(jié)果不如 PBS 緩沖體系。因此，本試驗(yàn)選擇0.02 mol/L pH7.2 的PBS 緩沖液作為NT-proBNP保存的基礎(chǔ)緩沖液。

另外，我們研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)緩沖液中常規(guī)添加10%小牛血清與1/1 000 防腐劑Proclin300 的情況下，添加抗生素(青霉素、鏈霉素)比單純添加其中一種抗生素能夠在37℃保存條件下延長(zhǎng)NT-proBNP保存時(shí)間1 d。這可能是因?yàn)檠遒|(zhì)控品中的成分較復(fù)雜，在制備及反復(fù)使用過程中存在細(xì)菌污染的情況，而細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中分泌的一些酶會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;另外，一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。因此，本試驗(yàn)通過研究確定在NT-proBNP 參考品的保存液中添加120 U/ml 青霉素與80 U/ml 鏈霉素，提高了NT-proBNP 的保存時(shí)間。

通過對(duì)NT-proBNP 血清保存各成分條件優(yōu)化，本試驗(yàn)最終確定了NT-proBNP 血清的保存液配方為0.02 mol/L pH7.2 的PBS 作為基礎(chǔ)緩沖液配制20%小牛血清，添加1/1 000 Proclin300、120 U/ml青霉素及80 U/ml 鏈霉素。該保存液保存的NTproBNP 參考品在37℃保存7 d 后檢測(cè)結(jié)果顯示線性關(guān)系良好，R2＞0.99，且37℃、4℃和-20℃中保存7 d 的NT-proBNP 參考品檢測(cè)結(jié)果無顯著差異(P ＞0.05)?；緷M足檢測(cè)試劑盒的保存要求。

試劑盒中血液制品有效期的確定可以通過加速降解實(shí)驗(yàn)及長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行［13，14］，加速降解實(shí)驗(yàn)通常的做法是:有效期1 年的試劑盒37℃放置7 d 后檢驗(yàn)，各項(xiàng)性能指標(biāo)均應(yīng)符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)確定的NT-proBNP 血清保存液能夠在37℃條件下保存NT-proBNP 7 d 不降解，初步滿足了一般檢測(cè)試劑中液體參考品保存期限的要求。后期我們將通過長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)最終確定NT-proBNP在該保存液中于4℃儲(chǔ)存條件下的實(shí)際保存期限。

本文為NT-proBNP 血清質(zhì)控品及常規(guī)檢驗(yàn)中血清的保存提供了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的保存方法，為后期試劑盒的建立提供了技術(shù)保障。

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