新等位基因HLA-A* 01∶130 的序列分析及HLA 分子三維結(jié)構(gòu)模擬

李 鑫 丁 鐫 侯 玲 王 鑫 顏廷宇 李繼紅 張春燕 趙素珍 劉 穎 劉 杰

(哈爾濱市血液中心，哈爾濱 150056)

人類白細(xì)胞抗原(HLA)復(fù)合體位于6 號(hào)染色體的短臂上，是迄今為止所知的人類最復(fù)雜的免疫遺傳多態(tài)系統(tǒng)。HLA 在機(jī)體免疫細(xì)胞的發(fā)育、免疫識(shí)別和特異性免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，是調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答的主要基因系統(tǒng)。隨著遺傳免疫學(xué)、分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人類對(duì)HLA 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識(shí)及闡明亦逐漸在完善，同時(shí)新的等位基因也不斷地被發(fā)現(xiàn)［1-3］。中華骨髓庫(kù)黑龍江分庫(kù)組織配型實(shí)驗(yàn)室在HLA 常規(guī)基因分型工作中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的HLA-A 等位基因，2013 年被世界衛(wèi)生組織 HLA 因子命名委員會(huì)正式命名為HLA-A* 01∶130。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 先證者為中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)黑龍江分庫(kù)志愿捐獻(xiàn)者，男性，33 歲(捐獻(xiàn)時(shí))，漢族，黑龍江籍，于2012 年約4000 樣本中檢出。

1.2 標(biāo)本DNA 提取 抽取志愿者外周靜脈血樣(EDTA 抗凝)5 ml，基因組DNA 提取應(yīng)用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA 提取試劑(美國(guó)Tiangen 公司)，檢測(cè)DNA 濃度 在40～100 ng/μl，OD260/280 比值為1.6～1.8。

1.3 HLA 基因分型 采用PCR-SBT 基因分型試劑盒(德國(guó)ROSE 公司，批號(hào):2012F)對(duì)HLA-A、B、DRB1 進(jìn)行常規(guī)測(cè)序分型，操作步驟嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)DNA 標(biāo)本用位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶純化及稀釋，然后作為模板，根據(jù)Sanger 法用含有第2、3、4 外顯子特異性雙向測(cè)序引物直接測(cè)序。測(cè)序儀為3730xl DNA Analyzer，采用序列分析軟件ATF-loader 進(jìn)行分析。

1.4 DNA 單鏈測(cè)序 HLA-A 位點(diǎn)采用組特異性擴(kuò)增，將2 個(gè)等位基因分開(kāi)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接被正反兩個(gè)方向測(cè)序，檢測(cè)出樣本的2、3、4 外顯子堿基序列。測(cè)序時(shí)應(yīng)用臺(tái)灣TBG 公司HLA ssureTMSE A Locus SBT Kit 測(cè)序試劑盒(批號(hào)AA13121K)，3730基因測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用AccuType 軟件分析。

1.5 新基因提交 序列經(jīng)GenBank 比對(duì)后，提交世界衛(wèi)生組織HLA 因子命名委員會(huì)申請(qǐng)認(rèn)可及正式命名。

1.6 HLA 分子三維結(jié)構(gòu)模擬 DNA 直接測(cè)序或間接測(cè)序得到的堿基序列，編碼為氨基酸序列，然后通過(guò)電子郵件傳送至Swiss-Model 進(jìn)行模擬，得到HLA分子的三維模擬圖像。

2 結(jié)果

2.1 SBT 結(jié)果 該樣本PCR-SBT 雙鏈混合測(cè)序結(jié)果為HLA-B* 40 ∶02，57 ∶03;HLA-DRB1* 07 ∶01，14∶02。該樣本A 位點(diǎn)序列與所有已知HLA-A 等位基因序列不一致。分析軟件無(wú)法給出與之完全匹配的HLA 基因分型結(jié)果。測(cè)序結(jié)果顯示該位點(diǎn)第3外顯子序列與同源性最高的等位基因組合HLA-A* 01∶66，02∶03 相比存在1 處不匹配(圖1)，即第3外顯子368 位核苷酸R(A+G)。

2.2 DNA 單鏈測(cè)序結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A 位點(diǎn)其中一個(gè)等位基因?yàn)镠LA-A* 02 ∶03 ∶01，另外一個(gè)HLA-A* 01 等位基因序列異常，DNA 序列分析表明該等位基因?yàn)樾禄颉y(cè)序結(jié)果所顯示的堿基差異在第3 外顯子368 位堿基發(fā)生了A→G 堿基替代(圖2)，導(dǎo)致相應(yīng)第99 位密碼子由TAT→TGT，其編碼氨基酸由酪氨酸(Tyr)→半胱氨酸(Cys)。

2.3 新基因確認(rèn) 將新等位基因序列提交基因庫(kù)得到申請(qǐng)?zhí)?HWS10018034，基因序列檢索號(hào)KC701038。該等位基因由世界衛(wèi)生組織HLA 因子命名委員會(huì)正式命名為HLA-A* 01∶130，并收錄進(jìn)入HLA Dictionary。

2.4 HLA 蛋白模擬三維結(jié)構(gòu) 經(jīng)Swiss-Model 模擬得到蛋白構(gòu)象是以同源性最高的HLA-Ⅰ類組織相容性抗原，HLA-A* 01α 鏈為模版進(jìn)行構(gòu)建(圖3)。

圖1 樣本HLA-A 位點(diǎn)的第三外顯子雙鏈測(cè)序結(jié)果Fig.1 Double-stranded sequencing of HLA-A in Exon3

圖2 HLA-A* 01 的第3 外顯子單鏈測(cè)序結(jié)果Fig.2 Single-stranded sequencing of HLA-A* 01 in Exon3

圖3 HLA-A* 01∶130 分子三維結(jié)構(gòu)模擬Fig.3 Modeling of three-dimensional structure of HLAA* 01∶130

圖4 新基因與HLA-A* 01∶01∶01、HLA-A* 01∶66 密碼子和氨基酸改變Fig.4 Novel allele with HLA-A* 01∶01∶01，HLA-A* 01∶66 codon and amino acid changes

3 討論

HLA 不同等位基因的區(qū)別主要在于高度多態(tài)性位點(diǎn)的堿基不同［4，5］，導(dǎo)致MHCⅠ類分子形成的多態(tài)性，MHCⅠ類分子是組織細(xì)胞內(nèi)抗原肽的遞呈者。MHCⅠ類分子多態(tài)性位點(diǎn)常位于α1、α2 結(jié)構(gòu)域，由第2、3 外顯子編碼的氨基酸構(gòu)成了α1、α2 結(jié)構(gòu)域，α1、α2 結(jié)構(gòu)域共同組成抗原肽結(jié)合區(qū)，是MHCⅠ類分子的可變區(qū)和抗原性多肽識(shí)別部位?？乖慕Y(jié)合區(qū)分為α 螺旋和β 片層兩部分(圖3)，抗原肽結(jié)合區(qū)β 片層有6 個(gè)小袋，分別用A、B、C、D、E、F 表示。而MHC 分子中氨基酸殘基的多態(tài)性在決定小袋的形狀、大小及電荷方面起重要作用，這使得它們剛好能容納某些抗原性肽氨基酸側(cè)鏈，氨基酸殘基組成及其構(gòu)型特點(diǎn)決定了MHCⅠ類分子結(jié)合抗原肽的特異性及結(jié)合能力。

HLA-A* 01∶130 是作者對(duì)中國(guó)造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者進(jìn)行常規(guī)HLA 基因分型時(shí)所發(fā)現(xiàn)的新等位基因。新等位基因的產(chǎn)生主要源于堿基突變、鏈間轉(zhuǎn)換及基因重組，其中以堿基突變多見(jiàn)［6］。部分堿基突變?yōu)殄e(cuò)義突變或無(wú)義突變，會(huì)造成氨基酸改變，從而使HLA 分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生相應(yīng)改變。也有同義突變，不產(chǎn)生突變效應(yīng)。HLA-A* 01∶130 與最相似的HLA-A* 01∶66 相比，在第3 外顯子368位核苷酸發(fā)生了堿基替代(A→G)，導(dǎo)致相應(yīng)第99位密碼子由TAT→TGT，其編碼氨基酸發(fā)生改變由酪氨酸→半胱氨酸。由于HLA-A* 01∶66 屬于2010年發(fā)現(xiàn)的新基因，因此我們將HLA-A* 01 ∶66、HLA-A* 01∶130 與同源性最高的HLA-A* 01∶01∶01 相互比較(圖4)。HLA-A* 01∶130 與HLA-A*01∶01∶01 相比在第3 外顯子有4 個(gè)堿基不同，導(dǎo)致3 個(gè)氨基酸發(fā)生改變即第95、97、99 位氨基酸，這種情況屬于錯(cuò)義突變。

與HLA-A* 01∶01∶01 相比，HLA-A* 01∶130 編碼氨基酸發(fā)生改變的3 個(gè)氨基酸均位于β 片層上，其中第97 位氨基酸是肽結(jié)合區(qū)C 袋、E 袋的組成部分，第99 位氨基酸是A 袋、B 袋、D 袋的組成部分，A 袋、C 袋均是與抗原多肽(9 肽)結(jié)合關(guān)鍵位置，第97 位、第99 位氨基酸是與抗原多肽結(jié)合的重要氨基酸之一。第97 位由異亮氨酸(Ile)→精氨酸(Arg)，導(dǎo)致非極性氨基酸(疏水氨基酸)變?yōu)闃O性不帶電荷氨基酸(親水氨基酸);第99 位由酪氨酸(Tyr)→半胱氨酸(Cys)，導(dǎo)致非極性氨基酸(疏水氨基酸)變?yōu)闃O性帶正電荷的氨基酸(親水氨基酸)。MHCⅠ類分子與抗原肽相互作用中某些關(guān)鍵部位或次要部位的氨基酸改變不僅可能影響MHC與多肽的特異結(jié)合并且直接影響其后對(duì)抗原肽的遞呈。

黑龍江地區(qū)漢族人群中A1-B57-DR7 屬于最常見(jiàn)HLA-A、B、DRB1 單體型(頻率0.86%)之一，在中國(guó)其他漢族人群中則不是常見(jiàn)單體型［7］。而在中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)黑龍江分庫(kù)志愿捐獻(xiàn)者中查詢A1-B57-DR7 高分辨基本全是A01 ∶01-B57∶01-DR07∶01，而本文中樣本卻是A01∶130-B57∶03-DR07∶01，HLA-A* 01 發(fā)生了改變，HLA-B57 也不是最常見(jiàn)的B57∶01，二者之間具體有什么相互關(guān)聯(lián)還有待于進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究。

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［3］聶向民，張 毅，房云海，等.人類白細(xì)胞抗原新等位基因DRB1* 1219 的確認(rèn)及其序列分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2011，28(1):99-102.

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［5］朱發(fā)明，呂沁風(fēng)，章 偉，等.一例新的HLA-B 等位基因B*5614 的核苷酸序列分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22(3):288-290.

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［7］劉 杰，張春燕，侯 玲，等.黑龍江地區(qū)漢族HLA-A、B、DRB1基因及單倍型的研究與應(yīng)用［J］.中國(guó)輸血雜志，2009，22(3):201-206.