抗CD20 單鏈抗體融合顯性抗原肽的原核表達(dá)和其抑瘤活性研究①

孫 蕊 朱 琰 馮海涼 卞曉翠 顧 蓓 王春景 劉玉琴

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)系和細(xì)胞資源中心，北京 100005)

目前腫瘤靶向治療在基礎(chǔ)研究和臨床實踐方面均取得顯著發(fā)展，其中單克隆抗體逐漸成為腫瘤靶向治療的主力軍。B 細(xì)胞淋巴瘤是一種血液系統(tǒng)疾病，采用傳統(tǒng)治療手段臨床療效較差。隨著對CD20分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的認(rèn)識，抗CD20 單克隆抗體的設(shè)計開發(fā)在B 細(xì)胞淋巴瘤的臨床治療中取得重要進(jìn)展。其中最具代表性的是1997 年美國FDA 批準(zhǔn)上市的人鼠嵌合抗CD20 單克隆抗體—Rituximab(C2B8，美羅華)。但人鼠嵌合抗體由于分子量大，穿透力弱，且毒副作用大，明顯限制了其臨床效果。近年來，一些人源化抗體、小型或改型抗體、基因修飾抗體逐漸發(fā)展起來。其中單鏈抗體(Single chain variable fragments，ScFv)由于其分子量小、穿透力強(qiáng)、能較好地保持抗原親和性及特異性、免疫原性低、體內(nèi)半衰期短，易與效應(yīng)分子相連構(gòu)成多種新功能的抗體分子，且在細(xì)菌等表達(dá)體系中易于大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，已經(jīng)成為應(yīng)用生物工程方法進(jìn)行腫瘤免疫治療的一種重要手段。本研究所構(gòu)建的重組融合蛋白ScFv-pLLO 是將針對CD20 的ScFv 與顯性抗原表位連接構(gòu)成一種新的免疫調(diào)節(jié)分子。

抗CD20 單抗的作用機(jī)制主要為抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、補(bǔ)體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(CDC)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(PCD)作用［1］。盡管哪種效應(yīng)機(jī)制在殺傷淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)揮主導(dǎo)作用目前尚存在爭論，但抗CD20 單克隆抗體大體被劃分為兩類:一型，這類單抗介導(dǎo)CDC 效應(yīng)強(qiáng)，但PCD 效應(yīng)相對較差;二型，這類抗體不能充分激活補(bǔ)體，但傾向于誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，如F(ab')2型［1-4］。抗CD20 單抗誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡主要存在兩種方式:一，直接跨膜傳遞信號，以溶酶體依賴的方式引起靶細(xì)胞PCD［2，5］，也可傳遞抗增殖信號，抑制靶細(xì)胞的生長;二，抗CD20 單抗之間廣泛交聯(lián)，激活細(xì)胞內(nèi)激酶，以非依賴溶酶體途徑(線粒體途徑)導(dǎo)致靶細(xì)胞PCD。其中二型抗CD20 單抗主要以溶酶體依賴方式直接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。而構(gòu)建抗CD20 的ScFv，由于缺少抗體的Fc 段，形式類似二型抗CD20 單抗，對瘤細(xì)胞的ADCC 和CDC 作用將大大降低，但有可能保留直接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的作用。而文獻(xiàn)報道CD20 分子本身作為抗原可被交叉遞呈給T 細(xì)胞，激活特異性T 細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生一個長效的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答［6］。我們想到利用ScFv 靶向結(jié)合CD20 分子的功能，將ScFv 與顯性的抗原肽融合，構(gòu)成一個重組的“生物導(dǎo)彈”，結(jié)合CD20 分子使之成為一個顯性的免疫原，更好地激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮一個長效的抗腫瘤免疫，彌補(bǔ)單鏈抗體效應(yīng)功能的降低。同時，這一重組蛋白還可以瘤細(xì)胞疫苗佐劑的形式發(fā)揮功能，將結(jié)合重組蛋白的滅活瘤細(xì)胞疫苗免疫接種小鼠，是否能更好促進(jìn)機(jī)體抗瘤效應(yīng)，這值得我們進(jìn)一步研究。李斯特菌是一種胞內(nèi)寄生菌，被巨噬細(xì)胞等吞噬后，能發(fā)生溶酶體逃逸，其分泌的李斯特菌溶細(xì)胞素O(Listeriolysin O，LLO)是協(xié)助李斯特菌溶酶體逃逸的關(guān)鍵分子，而機(jī)體產(chǎn)生的抗感染保護(hù)性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答主要針對的是LLO［7-10］，LLO 富含顯性的CD4+和CD8+T 細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)優(yōu)勢T 細(xì)胞擴(kuò)增，其中2 個顯性CD4+T 細(xì)胞表位由不同的研究小組確定，即LLO189-201 和LLO215-226［11-13］。在我們的研究中，采用這2 個抗原表位與抗CD20 的ScFv 融合，構(gòu)建了重組蛋白ScFv-pLLO，并初步分析了其免疫原性、靶向結(jié)合和抗淋巴瘤細(xì)胞活性，為下一步研究模擬瘤細(xì)胞抗原和作為疫苗佐劑的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI1640(改良)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)、D-Hank's 液、谷氨酰胺、雙抗(青霉素和鏈霉素)、B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Daudi、Raji、RAMOS 和NCI-BL2009，及人急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat E6-1 均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供。SPF 級BALB/c 小鼠，雌性，6～8 周齡，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動物中心提供。人工設(shè)計的重組融合蛋白ScFv-pLLO 基因序列和PCR 引物均由德國Invitrogen 公司合成，原核表達(dá)載體pET-30a(+)購自德國Novagen 公司，感受態(tài)菌DH5α 和BL21(DE3)購自北京TransGen Biotech 公司，限制性內(nèi)切酶Nde I 和Xho I 購自NEB 公司，T4 DNA 連接酶購自日本東洋紡公司，GelRed 預(yù)染DNA Marker、質(zhì)粒小量制備、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和即用型PCR MIX 購自上海GENERAY 公司，瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、刀豆蛋白A(Con A)和異丙基硫代半乳糖胺(IPTG)購自美國Sigma 公司，CO2+親和層析純化試劑盒購自Clontech 公司，去內(nèi)毒素試劑盒購自金斯瑞生物科技公司，預(yù)染蛋白質(zhì)Marker 購自美國Thermo Scientific 公司，Alexa Fluor 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit 購自Invitrogen 公司，CCK8試劑盒、RIPA(強(qiáng))裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司，Protein A+G Agarose 購自Santa Cruz biotechnology 公司，Human IGKV1-5 6·his fusionprotein (Immunoglobulin kappa variable 1-5)和抗人CD20 兔多抗(WB)購自美國Proteintech 公司，Anti-human CD20-PE 和CD20-FITC 抗體購自美國eBioscience公司，DyLight488 goat anti-mouse IgG［H+L］和His-Tag mouse 單抗(Co-IP、IF)購自北京聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，6 ×His(WB)鼠單克隆抗體購自O(shè)rigene公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ECL 化學(xué)發(fā)光液購自Engreen 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組蛋白基因序列構(gòu)建 查詢專利網(wǎng)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)已經(jīng)公布的專利信息，獲得抗人CD20 人鼠嵌合單克隆抗體(US005736137A，C2B8，商品名美羅華)VH(318 bp)和VL(363 bp)基因序列，分別編碼106 和121 個氨基酸。設(shè)計VL和VH之間連接肽Linker1 為(Gly3Ser)3，構(gòu)建抗CD20 單鏈抗體(ScFv)基因序列為VL-Linker1-VH。根據(jù)文獻(xiàn)［11-13］獲得強(qiáng)免疫原性分子李斯特菌溶細(xì)胞素O(LLO)的2 個顯性CD4+T 細(xì)胞表位LLO189-201 和LLO215-226:epitope1 WNEKYAQAYPNVS，epitope2 SQLIAKFGTAFK。設(shè)計連接肽Linker2 為Gly-Ser-Ser-Gly，構(gòu)建ScFv-Linker2-epitope1-Linker2-epitope2的融合基因序列。重組蛋白采用原核表達(dá)體系，為增加重組蛋白的可溶性功能表達(dá)，引入大腸桿菌外膜蛋白OmpA(gb|EU902989.1)信號肽編碼序列(SignalP):MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAP。設(shè)計的重組融合蛋白(ScFv-pLLO)基因序列SignalPScFv-Linker2-epitope1-Linker2-epitope2 為891 bp，由Invitrogen 公司合成并構(gòu)建于骨架質(zhì)粒pMK-RQ(KanR)，Gene name:Sun_Rui。設(shè)計PCR 引物擴(kuò)增融合基因:Forward，5'-CGC CGA ATT CCA TAT GAA AAA GAC AGC TAT CGC GA-3';Reverse，5'-CCG CTC GAG GCC GCC CTT AAA TGC AGT ACC A-3'，劃線處為引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 ScFv-pLLO 的克隆、表達(dá)和純化 PCR 擴(kuò)增ScFv-pLLO 基因序列，條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個循環(huán);72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-30a(+)空載質(zhì)粒同時進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切純化產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA 連接酶連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取單克隆進(jìn)行PCR 和測序驗證。測序正確的重組菌按1∶100 的比例接種到5 ml/支的LB 培養(yǎng)基中，按1∶1 000 的比例加入Kana 抗生素，37℃、250 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)，菌液的OD600 在0.6～0.8 時，將5 ml 菌液轉(zhuǎn)接至500 ml LB 培養(yǎng)基中，同時加入Kana 抗生素，繼續(xù)37℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h。加誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為0.5 mmol/L，23℃、220 r/min 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8～10 h。收集誘導(dǎo)菌液，4℃、5 500 r/min 離心30 min，沉淀用20 ml 過柱緩沖液重懸(TALON 1 × Equilibration/Wash)，加溶菌酶后置-80℃凍存，然后流水融化，反復(fù)3 次裂解菌體。裂解菌體經(jīng)超聲波處理降低黏稠度，功率為400 w(超聲10 s、間隔5 s、30 min)，然后12 000 r/min 離心40 min，取裂解上清過CO2+親和層析柱純化。純化蛋白用0.22 μm 濾膜過濾和去內(nèi)毒試劑盒去除內(nèi)毒素后，-20℃分裝凍存。

1.2.3 ScFv-pLLO 的SDS-PAGE 和Western blot 鑒定 制備電泳上樣樣品和分離膠濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠，各取38 μl 全菌、裂解菌液上清、沉淀懸液和純化蛋白加2 μl 1 mol/L DTT 和8 μl 6 ×SDS 上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，冷卻后樣品加至凝膠孔開始SDS-PAGE，電泳結(jié)束后膠塊經(jīng)染色和脫色處理直接觀察電泳條帶。或配制Tris 甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液，經(jīng)250 mA 恒定電流90 min，將蛋白樣品從膠塊轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上，5%的脫脂牛奶室溫封閉NC 膜2 h，TBST(0.01 mol/L TBS+0.05% Tween 20，pH7.4)洗膜2 次，每次10 min，然后用抗鼠6 ×His 單抗(3% BSA 1∶1 000 稀釋)4℃封閉過夜，TBST 充分洗滌3 次后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(5%脫脂牛奶1∶5 000 稀釋)室溫封閉2 h，TBST 洗3 次后，用ECL 發(fā)光液顯影曝光。

1.2.4 FCM 測定ScFv-pLLO 對淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合能力 取培養(yǎng)的B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Daudi、Raji、RAMOS 和NCI-BL2009，及T 細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat E6-1，先用FCM 的方法分析幾種細(xì)胞系表面CD20 分子的表達(dá)水平，具體操作:各細(xì)胞系取1 ×105細(xì)胞，用PBS 洗1 遍細(xì)胞后，1 000 r/min 離心5 min，100 μl PBS(含1% BSA+NaN3)重懸細(xì)胞，加5 μl 抗人CD20-PE 或CD20-FITC 單抗(實驗重復(fù)3次)，4℃孵育1 h，PBS 洗細(xì)胞2 次，最后用100 μl PBS 重懸細(xì)胞，用Accuri C6 流式細(xì)胞儀檢測。然后采用間接免疫熒光的方法檢測ScFv-pLLO 對淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合能力，同樣各細(xì)胞系取1 ×105細(xì)胞，PBS(含1% BSA+NaN3)重懸之后，加ScFv-pLLO 使其終濃度分別為5 μg/ml 和10 μg/ml，4℃孵育1 h，PBS 洗細(xì)胞1 次，100 μl PBS 重懸細(xì)胞，加1 μl His-Tag 鼠單抗，4℃孵育1 h，PBS 洗細(xì)胞1 次，重懸細(xì)胞后加1 μl DyLight488 山羊抗鼠IgG［H +L］熒光二抗，4℃孵育1 h，PBS 漂洗2 次后，重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 Co-IP 法檢測ScFv-pLLO 靶向結(jié)合CD20 分子的能力 收取T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞Daudi、Raji、RAMOS、NCI-BL2009 和Jurkat E6-1，1 000 r/min 離心5 min，棄培養(yǎng)基，用PBS 漂洗細(xì)胞1 次，然后用200～500 μl RIPA 裂解液冰浴裂解細(xì)胞1 h，12 000 r/min 離心40 min，小心吸取上清至新的EP管，加ScFv-pLLO 至細(xì)胞裂解液中，使其終濃度為10 μg/ml，充分混勻后4℃孵育2 h，按100∶1體積比加入His-Tag 鼠單抗，同時設(shè)置無關(guān)對照IgG 單抗組，4℃緩慢振搖孵育過夜，然后按100 μl/40 μl 的比例加入Protein A+G Agarose，4℃緩慢振搖孵育8 h，3 000 r/min 離心5 min，小心吸棄上清，沉淀用無菌PBS 小心漂洗5 次，加50 μl 1 ×SDS 上樣緩沖液，100℃煮沸10 min 制備電泳上樣樣品，分別以抗人CD20 兔多抗和6 ×His 鼠單抗為一抗，HRP 標(biāo)記羊抗兔和羊抗鼠IgG 為二抗進(jìn)行Western blot 實驗，分析ScFv-pLLO 能否靶向結(jié)合CD20。

1.2.6 ScFv-pLLO 對Raji 細(xì)胞生長的影響 取生長良好的Raji 和Jurkat E6-1 細(xì)胞(對照組)進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度均為1 ×105ml，以每孔100 μl 將細(xì)胞鋪至96 孔板，加入不同濃度的ScFv-pLLO 進(jìn)行培養(yǎng)，同時設(shè)置PBS 空白組和IGKV1-5 融合蛋白(免疫球蛋白κ 輕鏈可變區(qū)片段1-5)無關(guān)對照組。設(shè)置ScFv-pLLO 和IGKV1-5 的濃度梯度均為:5、10、20、50 μg/ml。每個濃度梯度做3 個平行孔，并以相應(yīng)體積的PBS 作為空白對照。將培養(yǎng)板置5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 試劑，繼續(xù)孵育3 h。BioTek SynergyTM4 酶標(biāo)儀讀取每孔在490 nm 處的吸光度值A(chǔ)490。計算不同組不同濃度下細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率=(APBS組-A實驗組)/APBS組×100%。

1.2.7 ScFv-pLLO 誘導(dǎo)Raji 細(xì)胞凋亡實驗 將Raji細(xì)胞以每孔1×106鋪于24 孔板，加入ScFv-pLLO，使其終濃度為20 μg/ml，同時設(shè)置PBS 空白組和IGKV1-5 融合蛋白對照組，將細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的24 h 和48 h 收集細(xì)胞，采用Annexin V-PI 雙染法檢測不同組凋亡細(xì)胞百分比，先用PBS 洗1 遍細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，配制1×Annexin-binding 緩沖液和100 μg/ml PI 溶液，然后用1×Annexin-binding 緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整體積為100 μl，加入5 μl Alexa Fluor 488 Annexin V 溶液和1 μl PI 溶液，室溫孵育15 min 后，用1 ml 1 × Annexinbinding 緩沖液洗1 遍細(xì)胞，最后留100 μl 體積重懸細(xì)胞，避光，用Accuri C6 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.8 ScFv-pLLO 刺激小鼠脾細(xì)胞增殖實驗 10只SPF 級BALB/c 小鼠用純化蛋白ScFv-pLLO 進(jìn)行免疫，抗原劑量為40 μg/只，與等量佐劑乳化后注射小鼠，每隔6 d 免疫1 次，共免疫3 次。其中基礎(chǔ)免疫使用弗氏完全佐劑，采用足墊注射，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，采用背部皮下多點(diǎn)注射。取末次免疫6 d 后(18 d 時)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實驗。將小鼠頸椎脫臼處死，75% 酒精浸泡5 min，置于無菌超凈臺中，在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，用無菌鑷子取出脾臟，放入盛有5 ml D-Hank's 液的培養(yǎng)皿中清洗脾臟，然后放于400 目篩網(wǎng)，用2 ml 注射器針芯輕輕研磨脾臟獲得脾細(xì)胞懸液，離心后用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，D-Hank's 液漂洗細(xì)胞2 遍，最后用5 ml RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 ×106，以每孔100 μl 將細(xì)胞鋪至96 孔板，加入ScFvpLLO，使其終濃度為20 μg/ml，同時設(shè)置PBS 空白組和Con A 陽性對照組，Con A 終濃度為5 μg/ml，不同小鼠來源的脾細(xì)胞每組均設(shè)置12 個平行孔。細(xì)胞置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 試劑，繼續(xù)孵育3 h。酶標(biāo)儀讀取每孔在490 nm 處的吸光度值A(chǔ)490，比較各組細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)分析采用t 檢驗，由SPSS16.0 統(tǒng)計軟件完成，結(jié)果以±s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pET-30a(+)-ScFv-pLLO 的構(gòu)建 人工合成重組基因序列全長891 bp，經(jīng)PCR 擴(kuò)增和雙酶切，成功克隆至pET-30a(+)原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)宿主菌，經(jīng)PCR 和DNA 測序驗證，挑選出陽性重組克隆菌(圖1)。

2.2 ScFv-pLLO 的表達(dá)、純化和鑒定 陽性克隆菌在1.0 mmol/L IPTG、37℃的誘導(dǎo)條件下，成功實現(xiàn)了重組融合蛋白ScFv-pLLO 的表達(dá)(圖2)，且在0.5 mmol/L IPTG、23℃的誘導(dǎo)條件下，ScFv-pLLO 大量以可溶形式存在，利用重組蛋白C 末端的(His)6 標(biāo)簽，將誘導(dǎo)上清經(jīng)CO2+親和層析柱純化，在分子量32 000 處有一明顯的純化蛋白條帶，大小與理論預(yù)測值相符(圖3)。以抗6 ×His 鼠單抗為一抗，進(jìn)行Western blot 鑒定，ScFv-pLLO 能夠被識別(圖4)。

圖1 重組質(zhì)粒pET-30a(+)-ScFv-pLLO 的PCR 驗證Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid pET-30a(+)-ScFv-pLLO

2.3 ScFv-pLLO 對淋巴瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合 以T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat E6-1 為對照，F(xiàn)CM 檢測B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Daudi、Raji、RAMOS 和NCIBL2009 細(xì)胞表面CD20 分子表達(dá)水平，結(jié)果顯示98%以上Daudi 細(xì)胞CD20 分子陽性，Raji 和NCIBL2009 細(xì)胞CD20 陽性率分別為89.7%和92.2%，而RAMOS 細(xì)胞CD20 陽性率是52.3%，Jurkat E6-1細(xì)胞為陰性(圖5)。采用流式間接免疫熒光法分析ScFv-pLLO 對淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合能力，結(jié)果顯示ScFv-pLLO 可不同程度地與幾種淋巴瘤細(xì)胞結(jié)合，當(dāng)濃度由5 μg/ml 增加到10 μg/ml 時，結(jié)合率進(jìn)一步增加(圖6)。Co-IP 實驗結(jié)果證實ScFv-pLLO 可特異靶向沉淀淋巴瘤細(xì)胞表面CD20 分子(圖7)。

2.4 ScFv-pLLO 對Raji 細(xì)胞的生長抑制作用 以Raji 細(xì)胞為例，分析ScFv-pLLO 對淋巴瘤細(xì)胞生長的作用。與對照蛋白IGKV1-5 相比，ScFv-pLLO 可明顯抑制Raji 細(xì)胞的生長，且抑制作用呈濃度依賴性(圖8)。ScFv-pLLO 的 濃 度 為5、10、20 和50 μg/ml 時，對Raji 細(xì)胞的抑制率分別為:(10.0±0.97)%、(27.7±1.59)%、(43.1±1.86)% 和(51.9±1.39)%(圖8)。與PBS 相比，ScFv-pLLO 和IGKV1-5 對Jurkat E6-1 對照細(xì)胞的生長均無影響(P ＞0.05)(圖8)。

圖2 SDS-PAGE 檢測ScFv-pLLO 的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 SDS-PAGE analysis of ScFv-pLLO expression in E.coli

圖3 ScFv-pLLO 的CO2+親和層析柱純化Fig.3 Purification of ScFv-pLLO by CO2+-based metal affinity chromatography column

圖4 ScFv-pLLO 的Western blot 鑒定結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of ScFv-pLLO expression in E.coli

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系CD20 表達(dá)水平Fig.5 Expression of CD20 in B-cell lymphomas cell lines detected by flow cytometry

2.5 ScFv-pLLO 誘導(dǎo)Raji 細(xì)胞凋亡的作用 Annexin V-PI 雙染法分析ScFv-pLLO 對Raji 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。FCM 結(jié)果顯示，與PBS 空白組和IGKV1-5 對照組相比，ScFv-pLLO 可明顯誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡(圖9)。20 μg/ml ScFv-pLLO 作用24 h后，可誘導(dǎo)24.6%的Raji 細(xì)胞凋亡(早期+晚期)，而PBS 和IGKV1-5 組細(xì)胞總凋亡率則分別為1.5%和1.7%;作用48 h 后，Raji 細(xì)胞總凋亡率可達(dá)47.0%，PBS 和IGKV1-5 組則分別為7.0%和7.9%(圖9)。

2.6 ScFv-pLLO 刺激小鼠脾細(xì)胞增殖作用 取ScFv-pLLO 免疫18 d 小鼠的脾細(xì)胞，體外進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實驗。結(jié)果顯示，與PBS 組相比，Con A 組和ScFv-pLLO 組淋巴細(xì)胞明顯增殖(圖10)。

圖6 ScFv-pLLO 對不同淋巴瘤細(xì)胞的免疫結(jié)合率Fig.6 Immune binding rates of ScFv-pLLO to different lymphomas cells

圖7 免疫共沉淀實驗檢測ScFv-pLLO 與CD20 分子之間的結(jié)合Fig.7 ScFv-pLLO binding to CD20 detected by Co-IP

圖8 ScFv-pLLO 對Raji 細(xì)胞生長的影響Fig.8 Effect of ScFv-pLLO on proliferation of Raji cells

圖9 ScFv-pLLO 誘導(dǎo)Raji 細(xì)胞凋亡Fig.9 Apoptosis of Raji cells induced by ScFv-pLLO

圖10 ScFv-pLLO 刺激淋巴細(xì)胞增殖Fig.10 Lymphocytes proliferation stimulated by ScFv-pLLO

3 討論

單克隆抗體具有高度的靈敏性和特異性，可封閉腫瘤細(xì)胞高表達(dá)受體、抑制腫瘤新生血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞毒免疫反應(yīng)，利用單克隆抗體開發(fā)腫瘤靶向制劑是腫瘤生物治療的熱點(diǎn)。迄今為止，在腫瘤靶向生物治療的發(fā)展歷程中，最成功的例子是抗CD20 單克隆抗體對于B 細(xì)胞淋巴瘤的治療。其中一個重要的原因是與CD20 分子本身的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點(diǎn)有關(guān)。CD20 是一種四次跨膜磷酸化蛋白，在體內(nèi)無天然配體，在血清中無游離形式存在，與特異性抗體結(jié)合后，既不內(nèi)化也不從細(xì)胞膜表面脫落，因此成為治療CD20 陽性B 細(xì)胞淋巴瘤的理想靶標(biāo)［14］。在抗CD20 單抗的臨床應(yīng)用過程中，鼠源或人鼠嵌合抗體易誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)，導(dǎo)致臨床療效持續(xù)時間較短，毒副作用顯著，因此一些人源化抗體和基因工程改造抗體逐漸發(fā)展起來［15］。人源化抗體制備復(fù)雜，成本較高，小型改造抗體由于生產(chǎn)成本低和易于規(guī)?；哂忻黠@發(fā)展優(yōu)勢。其中ScFv由于可以較好保持單抗結(jié)合抗原的特異性和親和性，分子量小和副作用少，發(fā)展前景較大。因此，構(gòu)建針對CD20 分子的ScFv 成為淋巴瘤生物治療研究的重要方面。

ScFv 相對于完整單克隆抗體，由于缺乏抗體Fc段，效應(yīng)功能有所降低，因此需連接效應(yīng)分子完善ScFv 的功能。本研究利用抗CD20 單抗C2B8 的輕、重鏈可變區(qū)構(gòu)建ScFv，并將其與2 個CD4+T 細(xì)胞顯性抗原表位連接組成一個重組融合蛋白。顯性抗原表位來自李斯特菌溶細(xì)胞素O(LLO)，LLO 是一個強(qiáng)大的免疫原性分子［9］，含有豐富的CD4+和CD8+T 細(xì)胞表位，易擴(kuò)增優(yōu)勢T 細(xì)胞群體，抗原表位LLO189-201 和LLO215-226 是經(jīng)文獻(xiàn)報道證實的2 個顯性T 細(xì)胞表位［11-13］。細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，本研究擬利用ScFv 的生物導(dǎo)向作用，將抗原表位攜帶至瘤細(xì)胞表面，增加瘤細(xì)胞抗原性，激活細(xì)胞免疫，產(chǎn)生長效的抗瘤效應(yīng)，或作為滅活瘤細(xì)胞疫苗佐劑，增強(qiáng)瘤苗的長效抗瘤作用。所構(gòu)建的重組融合蛋白ScFv-pLLO 被成功克隆至pET-30a(+)原核表達(dá)載體，并獲得了可溶性表達(dá)。蛋白經(jīng)親和層析純化和鑒定后，并初步分析了其靶向結(jié)合CD20 陽性淋巴瘤細(xì)胞的能力。流式細(xì)胞術(shù)和免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示ScFv-pLLO 可靶向結(jié)合瘤細(xì)胞表面CD20 分子，但對不同的淋巴瘤細(xì)胞系Daudi、Raji、RAMOS 和NCI-BL2009 具有不同的結(jié)合能力，如Daudi 和Raji 細(xì)胞CD20 陽性率均為85%以上，但ScFv-pLLO 的結(jié)合率卻存在很大差異。這可能與CD20 分子在瘤細(xì)胞表面的分布特點(diǎn)和ScFv-pLLO 的空間構(gòu)象有關(guān)。CD20 位于細(xì)胞膜上的脂筏區(qū)［16］，在胞內(nèi)與多種信號分子相連，通過其他分子與BCR 組成BCR-CD20 復(fù)合物［17］，體外建立的不同人B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系表面分子和脂筏區(qū)不同。而人工設(shè)計添加的LLO 抗原肽可能導(dǎo)致ScFv 空間構(gòu)象和蛋白電荷性質(zhì)的改變，致使ScFvpLLO 與CD20 結(jié)合的特異性和親和力有所改變，從而對不同細(xì)胞系結(jié)合率不同。這為我們下一步優(yōu)化重組蛋白設(shè)計，合成靶向性、特異性更高的重組肽疫苗提供數(shù)據(jù)。此外，ScFv-pLLO 可抑制Raji 細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)Raji 細(xì)胞凋亡，說明重組蛋白的ScFv 結(jié)構(gòu)很可能保留了抗CD20 單抗直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但這與CD20 分子在淋巴瘤細(xì)胞表面的分布特點(diǎn)密切相關(guān)［2，17］。重要的是ScFv-pLLO 可刺激免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖，顯示出良好的免疫原性，這為我們下一步研究其結(jié)合瘤細(xì)胞后激活細(xì)胞免疫和發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的功能奠定基礎(chǔ)。

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