MyD88 依賴途徑介導(dǎo)云芝糖肽對(duì)荷瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制研究①

馮子芳 汪志學(xué) 周麗菁 鮑依稀 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400010)

云芝糖肽(Polysaccharopeptide，PSP)，是從云芝COV-1 菌株菌絲體培養(yǎng)物中提取的活性物質(zhì)。PSP的分子量約為10 kD，具有極高的水溶性，早期研究結(jié)果表明PSP 具有抗腫瘤、抗炎癥及緩解放化療引起的免疫抑制等作用［1，2］。因其低致畸性和低致突變性，在亞洲國(guó)家，PSP 正作為免疫調(diào)節(jié)劑及輔助抗腫瘤藥物被廣泛使用［3，4］。PSP 本身不具有化學(xué)活性、毒性，也不構(gòu)成直接的基因表達(dá)調(diào)控因子，PSP的活性是通過激活免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特異性地調(diào)控細(xì)胞體內(nèi)的基因表達(dá)。為明確PSP 免疫調(diào)節(jié)的信號(hào)通路機(jī)制，我們團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)PSP 可以顯著上調(diào)TLR4 通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因及蛋白表達(dá)水平，表明Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是PSP 的免疫受體之一［5，6］。TLR4 信號(hào)通路下游共有兩條通路:分別是髓樣細(xì)胞分化因子88(Myeloid different factory 88，MyD88)依賴途徑和MyD88 非依賴途徑(也稱作TRIF 途徑)［7-9］。既往報(bào)道雖對(duì)PSP 提高免疫功能研究較多，但對(duì)其TLR4 下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究甚少，為探討PSP 對(duì)基因缺陷EAC 實(shí)體型荷瘤小鼠免疫功能的影響，并初步確定其對(duì)小鼠MyD88 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用野生型C57BL/6 小鼠和同種系MyD88 基因缺陷小鼠(MyD88-/-)進(jìn)行對(duì)比研究，明確PSP 是通過MyD88 依賴途徑發(fā)揮效應(yīng)，從而探索PSP 的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與腫瘤 雌性野生型(WT)C57BL/6 小鼠8 只，體重(18±22)g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;雌性基因缺陷型組(MyD88-/-)組6 只，體重(18±22)g，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;艾氏腹水癌(EAC)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，C57BL/6 小鼠腹腔傳代接種。

1.2 儀器與試劑 PSP(購(gòu)自江蘇華源生物有限公司，批號(hào)20120604)，純度為90%，無(wú)菌生理鹽水溶解后4℃保存?zhèn)溆?RIPA 裂解液(碧云天公司);RNAiso Plus 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A SYBR Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa 公司);兔抗小鼠TLR4、TRAM 及TRIF 抗體(Abcam 公司);兔抗小鼠MyD88，TRAF6 抗體(Epitomics 公司);兔抗小鼠兔抗小鼠NF-κB 抗體及c-Jun 抗體(AP-1 的組成部分)(Cell signaling 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(H+L)抗體及鼠抗β-actin 抗體(碧云天公司);羊抗兔IgG-HRP(博士德公司)等;定量PCR 儀(Bio-Rad CFX96)。

1.3 方法

1.3.1 EAC 實(shí)體型荷瘤小鼠模型的建立 在無(wú)菌條件下，將EAC 細(xì)胞懸液腹腔注射C57BL/6 小鼠2只，生長(zhǎng)8～9 d 后，頸椎脫臼處死后用75%乙醇消毒腹部抽取腹水，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成濃度為5×106ml-1的瘤細(xì)胞懸液，于每只小鼠的右側(cè)腋窩皮下接種0.2 ml 約8～10 d 可長(zhǎng)出可觸及的實(shí)體瘤結(jié)節(jié)，成功率近100%，接種后立即稱重，次日開始用藥［10］。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理 小鼠分為2 組:野生型組(WT 組)與基因缺陷型組(MyD88-/-組)，每組6 只。接種次日開始用藥:灌胃云芝糖肽(PSP)［500 mg/(kg·d)，0.2 ml］給藥后每日觀察小鼠的食欲，大便，毛色，活動(dòng)等一般狀況，連續(xù)給藥22 d 后，稱小鼠體重，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠并于無(wú)菌條件下解剖小鼠，分別取出小鼠的脾臟、胸腺和實(shí)體瘤組織，并稱重。后將脾組織于液氮中迅速冷卻然后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存，眼球血取血清后存于-20℃冰箱保存。

1.3.3 小鼠眼球血清的獲取及檢測(cè)

1.3.3.1 抓取小鼠后固定，輕壓取血側(cè)眼部皮膚，使眼球充血突出，用彎頭鑷夾取眼球，使血液以垂直方向流入離心管，直至血液流盡，將離心管靜置37℃水浴箱水浴1 h，待血液凝固后，將其平衡后離心(4 000 r/min，離心10 min)，后于4℃冰箱放置1 h，析出血清于干凈的離心管中，標(biāo)記后保存于-20℃待用。

1.3.3.2 ELISA 檢測(cè)終端效應(yīng)因子 眼球血均采用ELISA 法檢測(cè)終端效應(yīng)細(xì)胞因子水平，具體操作方法按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 Q-PCR 檢測(cè)TLR4 通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因水平變化。

1.3.4.1 脾臟總RNA 的提取和cDNA 的合成 取約30 mg 脾臟組織，液氮研磨后加入1 ml TRIzol 裂解，后加200 μl 氯仿抽提，4℃離心，轉(zhuǎn)移上層水相加500 μl 異丙醇沉淀RNA，4℃離心，加入1 ml 新配的75%乙醇洗滌，待干燥后加入40 μl RNA-Free水溶解，用紫外分光光度計(jì)(Beckman，DU730)檢測(cè)RNA 的濃度，電泳檢測(cè)RNA 完整性，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)操作步驟將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃待用。

1.3.4.2 Q-PCR 各引物最佳退火溫度摸索 實(shí)驗(yàn)所需引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成(引物序列及相關(guān)信息見表1)。采用溫度梯度法摸索各引物的最佳退火溫度，所有Q-PCR 均采用10ul 反應(yīng)體系:5 μl SYBR Premix ExTaqTMⅡ;1 μl 引物(上下游引物濃度均為500 nmol/L);3 μl 的RNA-Free 水和1 μl 的cDNA。反應(yīng)條件為95℃30 s，95℃5 s，各引物的退火溫度30 s，共40 循環(huán)以及自帶的用來觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和引物的有效性軟件:溶解曲線檢測(cè)程序。由于每對(duì)引物在56℃都有較好的擴(kuò)增效率，最終選定56℃為各對(duì)引物的退火溫度。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)TLR4 通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白水平變化 ①取脾臟組織，置于研缽內(nèi)液氮研磨，加入RIPA 裂解液(含蛋白酶抑制劑與磷酸化酶抑制劑)，靜置15 min，4℃，12 000 r/min 離心20 min，取上清，BCA 法測(cè)蛋白濃度;②經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm 的PVDF 膜上，用5% BSA 37℃封閉1 h;③封閉后加入相應(yīng)濃度一抗，4℃過夜;④用TBST 洗膜3 次，每次15 min，加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h;⑤用TBST 洗膜3 次，方法同上，ECL(碧云天)顯影，然后采用Quantity One 軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 建模小鼠狀況 右側(cè)腋窩皮下接種0.2 ml EAC 細(xì)胞后8～10 d 內(nèi)所有小鼠均長(zhǎng)出可觸及的實(shí)體瘤結(jié)節(jié)，荷瘤小鼠模型建立成功，成功率100%。于每日給藥后觀察小鼠狀態(tài)，其精神、飲食、活動(dòng)、尿液、糞便等均未見異常，眼、耳、鼻、口處未見分泌物。

2.2 PSP 對(duì)荷瘤小鼠外周血中Th1/Th2 類細(xì)胞因子分泌水平的影響 取處理后的MyD88-/-組和WT 組小鼠眼球血血清，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MyD88-/-組和WT 組腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、干擾素-γ(Interferon gamma，IFN-γ)、白介素2(Interleukin-2，IL-2)、IL-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-10(Interleukin-10，IL-10)等Th1/Th2 類細(xì)胞因子分泌量顯著增加(P ＜0.05)，表明PSP 可刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但MyD88-/-組上述因子的分泌量與WT 組相比均有所降低(P ＜0.05)。見圖1。

2.3 Q-PCR 各引物的擴(kuò)增效率 每對(duì)引物根據(jù)上述步驟操作以后由Bio-Rad CFX Manager software 自動(dòng)計(jì)算出引物的擴(kuò)增效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性控制在0.990 以上。其信息包括:擴(kuò)增效率(E)和可重復(fù)性(R)，見表1。

2.4 PSP 對(duì)荷瘤小鼠脾臟TLR4 信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)的影響 取處理后的MyD88-/-組和WT 組小鼠脾臟，采用Q-PCR 進(jìn)行檢測(cè)TLR4 通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因，結(jié)果顯示:兩組小鼠脾臟中TLR4 信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平均明顯升高(P ＜0.05)，且兩組小鼠脾臟中TLR4 及MyD88 非依賴途徑的相關(guān)基因易位關(guān)聯(lián)膜蛋白(Translocation associated membrane protein，TRAM)與TIR 結(jié)構(gòu)域接頭分子(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)表達(dá)水平的上調(diào)幅度無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，而MyD88-/-組小鼠脾臟中MyD88 基因完全敲除，基因表達(dá)量為零，且MyD88 依賴途徑的相關(guān)基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF 6)、核因子B(Nuclear factor-kappa-B，NF-кB)、活化蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)表達(dá)水平雖有上調(diào)，但與WT 組比MyD88-/-組上調(diào)幅度有所降低(P ＜0.05)。見圖2。

表1 Q-PCR 所使用各引物序列及其相關(guān)信息Tab.1 Sequence and useful information of primers designed for Q-PCR

圖1 ELISA 檢測(cè)WT 組與MyD88 -/-組小鼠眼球血中終端效應(yīng)因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 及IL-10 的分泌量Fig.1 Terminal effect factors secretion of IL-2，IL-6，IL-10，TNF-α and IFN-γ between WT group and MyD88 -/- group by ELISA

圖2 Q-PCR 檢測(cè)WT 組與MyD88 -/- 組小鼠脾臟中TLR4 通路相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative gene expression levels in spleens between WT group and MyD88 -/-group were analyzed by Q-PCR

2.5 PSP 對(duì)小鼠脾臟TLR4 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取處理后的MyD88-/-組和WT 組小鼠脾臟，采用Western blot 進(jìn)行檢測(cè)TLR4 通路相關(guān)蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示:MyD88-/-組和WT 組小鼠脾臟中TLR4 蛋白的表達(dá)水平均明顯升高(P ＜0.05)，兩組小鼠脾臟中TLR4 及MyD88 非依賴途徑的相關(guān)蛋白TRAM、TAIF 表達(dá)水平上調(diào)幅度無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，而MyD88-/-組小鼠脾臟中MyD88 因完全敲除，蛋白表達(dá)量為零，而TRAF6、NF-кB、AP-1 表達(dá)水平上調(diào)幅度較WT 組有所降低(P ＜ 0.05)。見圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)WT 組與MyD88 -/-組小鼠脾臟TLR4、MyD88、TRAM、TRIF、TRAF6、NF-кB 和AP-1 蛋白水平的變化Fig.3 Changes of TLR4，MyD88，TRAM，TRIF，TRAF6，NF-кB and AP-1 protein levels between WT group and MyD88 -/- group by Western blot

3 討論

云芝糖肽是從真菌云芝菌絲中提取的提取物，其膠囊是國(guó)家二類新藥，應(yīng)用于腫瘤患者，具有補(bǔ)益精氣，扶正固本的功效。云芝作為我國(guó)傳統(tǒng)的能夠提高機(jī)體免疫功能的免疫類中藥，大量的藥理學(xué)和臨床學(xué)研究證明:PSP 能顯著增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，并能減輕因放療、化療引起的各種毒副反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等［3，11］。另外根據(jù)我們團(tuán)隊(duì)的一系列臨床研究，發(fā)現(xiàn)PSP 能顯著增加鼻咽癌患者和乳腺癌患者的CD4 細(xì)胞數(shù)量、CD4/CD8(Ts +Tc)的比值以及T、B 淋巴細(xì)胞的平衡與反應(yīng)，并促進(jìn)IL-2、TNF-α 與IFN-γ 等Th1/Th2 類細(xì)胞因子的釋放;此外在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PSP 能顯著增加荷瘤小鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值，并能促使荷瘤小鼠脾臟中IL-2和IL-2R 的高效表達(dá)，及腫瘤組織中的Bax 水平提高而Bcl-2 和CDK4 水平顯著降低［5，6，10］，國(guó)內(nèi)還有許多關(guān)于服用PSP 前后的腫瘤患者淋巴細(xì)胞亞群變化的大量研究［1-4］，結(jié)果皆一致，說明PSP 在提高腫瘤患者免疫功能、增加患者對(duì)化療的耐受性及提高患者生存質(zhì)量等方面有明顯效果［10，11］。以上敘述無(wú)論是臨床試驗(yàn)還是動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)皆證實(shí)了PSP 的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用。

有研究表明，中藥多糖是通過對(duì)TLR 信號(hào)通路的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用的［12，13］。為此我們利用基因芯片、Western blot、Q-PCR 等技術(shù)檢測(cè)PSP對(duì)健康成人及乳腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)Toll 樣受體信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)PSP 可以顯著上調(diào)TLR4 通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因及末端蛋白表達(dá)水平，另外發(fā)現(xiàn)PSP 作用后的荷瘤小鼠，其脾臟TLR4 通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)水平均明顯升高，明確PSP 是通過TLR4 信 號(hào) 通 路 發(fā) 揮 其 免 疫 調(diào) 節(jié) 作 用［5，6］。由MyD88 承接的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為MyD88 依賴途徑，是幾乎所有TLRS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路(TLR3 除外)，而MyD88 非依賴途徑主要存在于TLR3 和TLR4中［14，15］。MyD88 與TRIF 及其介導(dǎo)的信號(hào)途徑作為TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要組成部分，在PSP 的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤過程中是否都發(fā)揮作用，亟待我們進(jìn)一步研究。

艾氏腹水癌(Ehrlich's ascites carcinoma，EAC)由Ehrlich 氏癌(自發(fā)性乳腺癌)細(xì)胞生理鹽水懸液注入小鼠腹腔內(nèi)而成，常廣泛用于腫瘤治療藥物的篩選及腫瘤機(jī)制研究，是國(guó)內(nèi)外常用的可移植性瘤細(xì)胞株之一［16，17］。在本實(shí)驗(yàn)中，利用MyD88 敲除小鼠與同種系的C57BL/6 野生型小鼠采用EAC 細(xì)胞接種到小鼠右腋皮下，建立實(shí)體型荷瘤小鼠模型，形成鮮明對(duì)比，在研究中發(fā)現(xiàn)，PSP 可以顯著上調(diào)荷瘤小鼠脾臟TLR4 通路中TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、NF-кB、AP-1 的基因相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)Western blot也驗(yàn)證了PSP 對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白TLR4、TRAM、TRIF、TRAF6、NF-кB、AP-1 的上調(diào)作用，但MyD88-/-組與WT 組相比較，TLR4 的基因與蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯差別，因?yàn)門LR4 是MYD88 的上游基因，MYD88 的敲除對(duì)其的上游通路無(wú)影響;而MyD88-/-組小鼠由于MyD88 基因的完全敲除，因此實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到MyD88 的基因及蛋白表達(dá)量均為零;但MyD88-/-小鼠雖阻斷了MyD88 依賴途徑這條通路，但由于TRAF6 是兩條途徑的交叉節(jié)點(diǎn)，TRAF6 激活后，繼而激活NF-кB，最終使得AP-1 表達(dá)量增加，因此結(jié)果顯示MyD88-/-組荷瘤小鼠外周血中的終端效應(yīng)因子及脾臟中的基因和蛋白表達(dá)量較WT 組僅有所降低并不會(huì)完全沒有。因此結(jié)果顯示MyD88-/-組荷瘤小鼠脾臟中TRAF6、NF-кB、AP-1 的基因及蛋白表達(dá)量較WT 組有所降低。另外ELISA 也檢測(cè)到PSP 能夠促進(jìn)終端效應(yīng)因子的分泌。干擾素(Interferon，IFN)，可抵抗病毒的感染，干擾病毒的復(fù)制且具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞增殖等作用，有研究表明PSP 可刺激細(xì)胞因子IFN-γ 的產(chǎn)生，而沒有任何毒副作用;腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)是能直接造成腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子，TNF-α 是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，有研究表明PSP 在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及TNF-α等炎癥介質(zhì)的量;白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)的主要作用是促使T、B 細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)NK 細(xì)胞及單核細(xì)胞殺傷活性，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，刺激造血細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血小板的生成等。而其中IL-2，IFN-r 等炎性介質(zhì)在體內(nèi)主要由T 細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)信號(hào)通路產(chǎn)生，IL-6，IL-10 等主要由Toll 樣蛋白受體信號(hào)通路(TLR)誘導(dǎo)釋放，因此本試驗(yàn)選擇TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10 作為驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)上述效應(yīng)因子表達(dá)水平均明顯升高，表明PSP 可刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但由于PSP 通過激活TLR4 介導(dǎo)上述通路相關(guān)基因表達(dá)量的增加進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)細(xì)胞因子和干擾素的表達(dá)［18-20］，因此結(jié)果顯示MyD88-/-組荷瘤小鼠外周血中的終端效應(yīng)因子較WT 組均有所降低。

綜上分析，本次的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MyD88 依賴途徑是云芝糖肽發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的通路之一，而TRIF 與TRAM 合稱為MyD88 非依賴途徑，也稱作TRIF 途徑，從圖2 與圖3 可看出TRIF 與TRAM 的表達(dá)量均明顯增加，且MyD88-/-組較之WT 組有所增加，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此TRIF 依賴途徑是否也可能是云芝糖肽發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的通路之一還待進(jìn)一步研究確認(rèn)，盡管人們對(duì)TRIF 依賴途徑的認(rèn)識(shí)比MyD88 依賴途徑晚一些，可是近年來關(guān)于TRIF 途徑的相關(guān)研究讓人們對(duì)TLRs 在免疫反應(yīng)中的作用及許多腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展有了更新更多的認(rèn)識(shí)。為此下一步我們將針對(duì)TRIF 途徑進(jìn)行更深入的研究，為進(jìn)一步闡明PSP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為PSP 更好地應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

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