β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠Treg/Th17 細(xì)胞比率變化的研究①

徐 立 王峻松 閆 巖 劉 磊 戴鶴玲 付 嘉 方艷秋 譚 巖

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長春 130041)

抗磷脂抗體綜合征(Antiphospholipid syndr- ome，APS)為一組自身免疫系統(tǒng)疾病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)和血小板減少癥等。APS 除原發(fā)性外，也有繼發(fā)性疾病。血栓形成是APS 突出的臨床表現(xiàn)和主要的病理變化［1］。Charavi 等［2］的研究認(rèn)為，APS 患者血栓形成的基礎(chǔ)為血清中存在高濃度抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，aPL)。aPL 是針對帶負(fù)電荷磷脂的一組自身抗體，主要包括磷脂結(jié)合蛋白如β2-糖蛋白1(β2-glycoprotein l，β2-GP1)、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、annexinV 等而產(chǎn)生病理生理反應(yīng)［3］。研究認(rèn)為β2-GP1 是aPL 的主要靶抗原之一［4，5］，其是肝細(xì)胞合成的并存在于血漿中的一種糖蛋白，由于其本身存在磷脂結(jié)合位點(diǎn)，又稱為載脂蛋白H(ApoH)，是抗磷脂抗體和磷脂結(jié)合的輔助因子。自身免疫系統(tǒng)疾病免疫細(xì)胞參與其發(fā)病機(jī)制是必不可少的，初始CD4+T 細(xì)胞可分化為Th1、Th2 和Th17、Treg 4 個(gè) 主 要 的 細(xì) 胞 亞 群，Th17、Treg 亞群不同于經(jīng)典的Th1、Th2 亞群，其與自身免疫性疾病和感染免疫有密切關(guān)系，通過產(chǎn)生特征性的細(xì)胞因子發(fā)揮其功能［6］。TGF-β 單獨(dú)可誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞分化為Treg 細(xì)胞，分泌TGF-β 并表達(dá)標(biāo)志性分子Foxp3，主要維護(hù)機(jī)體免疫平衡;低濃度的TGF-β 和IL-6 的聯(lián)合可誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞，主要分泌lL-17細(xì)胞因子發(fā)揮其功能。因此，TGF-β 這種雙重效應(yīng)在T 細(xì)胞分化過程中具有重要的作用［7］。Treg細(xì)胞和Th17 細(xì)胞已成為當(dāng)今免疫學(xué)方面研究的熱點(diǎn)之一，Th17/Treg 平衡越來越多地得到專家們的認(rèn)可和關(guān)注，資料顯示CD4+CD25+Treg/Th17細(xì)胞失衡在許多免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而CD4+CD25+Treg/Th17 細(xì)胞失衡是否參與調(diào)控抗磷脂綜合征的發(fā)病機(jī)制國內(nèi)外鮮見報(bào)道。

為了探索CD4+CD25+Treg/Th17 數(shù)量與比值的變化是否調(diào)控APS 的發(fā)病，本研究組以原核表達(dá)人β2糖蛋白1(rhβ2GP1)免疫BALB/c 小鼠建立APS 動物模型，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg/Th17 細(xì)胞頻率及比值變化，揭示APS 發(fā)病的細(xì)胞免疫病理基礎(chǔ)，為疾病治療尋找靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PE-anti-CD4 單抗、FITC-anti-CD25單抗及同型對照γ1/γ2(BD 公司)，PE-anti-IL-17 單抗(eBioscience)，小鼠抗人β2GP1 抗體(鼎國生物公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術(shù)公司)，CFA(Sigma)，心磷脂標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)，β2GP1 標(biāo)準(zhǔn)品(Advtech)，IL-6、IL-2、IL-17、TGF-β 定量ELISA 試劑盒(R＆D 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c 小鼠，雌性，8～10 周，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，無特定病原菌(Specific pathogen free，SPF)條件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 人β2糖蛋白1 的重組表達(dá)詳見文獻(xiàn)［8］。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)性APS 模型的建立詳見文獻(xiàn)［9］。

1.3.3 外周血CD4+CD25+Treg、Th17 細(xì)胞的檢測分別在免疫后4、8、12、16、20 周無菌取小鼠尾靜脈血，肝素抗凝。取100 μl 全血，分別加入抗CD4、抗CD25、抗IL-17 抗體各10 μl，另設(shè)對照管，加入同型陰性對照γ1/γ2，室溫孵育20～30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，室溫孵育10 min，1000 r/min 洗滌5 min，棄上清，將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS 洗滌液中，振蕩混勻后上機(jī)檢測淋巴細(xì)胞亞群及CD4+CD25+Treg、Th17 細(xì)胞亞群水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA 分析，組間比較采用方差分析，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠APS 標(biāo)志變化 與對照組相比，模型組小鼠的anti-β2GP1 和aCA 滴度升高，流產(chǎn)率升高，PLT 降低，APTT 延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果見圖1。

圖1 模型組APS 標(biāo)志物的變化Fig.1 Values of markers in EAPS

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測4 至20 周Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞變化Fig.2 Detection of Treg and Th17 cells from 4 w to 20 w by flow cytometry

圖3 各組CD4 +CD25 +Treg/Th17 細(xì)胞頻率變化比較Fig.3 Compared with control group，alteration of percentages and ratio of CD4 +CD25 +Treg/Th17

2.2 小鼠PBMC 中CD4+CD25+Treg、Th17 細(xì)胞的變化 分別在免疫后4、8、12、16 和20 周流式檢測模型及對照組小鼠的CD4+CD25+Treg 和Th17 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞頻率在4、8 周未見明顯變化(P ＞0.05)，但12 周后開始逐漸下降(P ＜0.05);而Th17細(xì)胞頻率隨時(shí)間增加逐漸升高，與同時(shí)間段對照相比差異顯著(P ＜0.05);CD4+CD25+Treg/Th17 比值隨時(shí)間逐漸下降，與正常對照組相比差異顯著(P ＜0.05)。對照組在不同時(shí)間點(diǎn)的兩種細(xì)胞的頻率均無差異(P ＞0.05)。結(jié)果見圖2、3。

圖4 與對照組比較，EAPS 組細(xì)胞因子水平的變化Fig.4 Compared with control group，values of cytokines in EAPS

2.3 β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠免疫因子水平變化 與對照組相比，β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠靜脈血中IL-17、IL-2 及IL-6 水平明顯升高，而TGF-β 水平下降(P ＜0.05)。結(jié)果見圖4。

3 討論

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome，APS)為一類系統(tǒng)性自身免疫疾病，其特征主要為血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)及一組自身抗體持續(xù)陽性［10］。研究表明，血清中存在高滴度的抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody，aPL)是患者形成血栓的關(guān)鍵［11］，而其中β2糖蛋白1(beta-2-glycoprotein 1，β2GP1)又是aPL 的關(guān)鍵靶抗原，是磷脂與其抗體(anti-β2GP1)結(jié)合的輔助因子，在APS 血栓形成的病理過程中發(fā)揮著重要作用，其主要在肝臟合成［12］。

自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病的關(guān)鍵是正常的免疫平衡被打破，繼而產(chǎn)生了一系列針對自身正?？乖目贵w，從而引發(fā)了強(qiáng)烈免疫應(yīng)答［13］。CD4+CD25+Treg 是由Sakaguchi 等［14］在1995 年首先提出來的，其缺失可引起小鼠自身免疫性疾病，而過繼免疫則可預(yù)防其發(fā)生，其主要表達(dá)CD4、CD25 和標(biāo)志性分子Foxp3，后者對此類細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持具有重要作用。CD4+CD25+Treg 具有免疫抑制和免疫無能兩大特性，對維持機(jī)體自身免疫耐受具有重要作用，其數(shù)量或功能改變均可導(dǎo)致免疫失衡，尤其減少可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生［15-18］。Th17 主要分泌IL-17A 而被命名。其還可以分泌IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)等細(xì)胞因子。在自身免疫性疾病及炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的作用，視黃酸相關(guān)孤兒核受體(RORyt)為Th17 主要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Th17 分化。Treg 和Th17 細(xì)胞的平衡對免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用，自身免疫性疾病與感染性疾病往往表現(xiàn)為兩者的失衡。Treg 和Th17 細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)主要通過不同的細(xì)胞因子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的。IL-17 為促炎因子引起炎癥和自身免疫反應(yīng)。CD4+CD25+Treg 調(diào)節(jié)T細(xì)胞則具有有較強(qiáng)的免疫抑制作用。促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg 細(xì)胞失衡可能是自身免疫性疾病發(fā)病的一個(gè)關(guān)鍵因素，因此，調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞比例，糾正兩者的失衡可能成為自身免疫性疾病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

在本研究中，首先應(yīng)用重組hβ2GP1 免疫小鼠，成功誘導(dǎo)出了自身抗體anti-β2GP1 和aCA，并出現(xiàn)了APS 相關(guān)的促凝血表現(xiàn):APTT 延長及血小板升高等。EAPS 模型組細(xì)胞IL-17、IL-6 及IL-2 滴度顯著升高，而TGF-β 滴度顯著降低。免疫4～8 周，模型組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比率基本無改變，而后逐漸降低，均低于對照組。因前4 周為自身反應(yīng)性T/B 淋巴細(xì)胞增殖活化時(shí)期，CD4+CD25+Treg 與效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞暫時(shí)維持動態(tài)平衡，此時(shí)機(jī)體對自身組織仍處于耐受狀態(tài)［19］。同時(shí)，源于自身免疫應(yīng)答產(chǎn)生的大量致炎因子如IL-17［20］、IL-6［21］、TGF-β等均可不同程度抑制CD4+CD25+Treg 的功能，因此該代償性平衡是有限度的，一旦平衡被打破，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比率則開始下降，但Th17 細(xì)胞在IL-6 和低濃度TGF-β 同時(shí)作用的情況下表達(dá)逐漸升高，均高于對照組。當(dāng)CD4+CD25+Treg 的抑制功能不足以維持免疫平衡，以致其他效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞不斷增殖，CD4+CD25+Treg/Th17 比值明顯低于對照組，就會導(dǎo)致APS 的發(fā)生。該研究結(jié)果揭示，CD4+CD25+Treg/Th17 在EAPS 免疫病理發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示EAPS 小鼠血漿中Th17/Treg 失衡(細(xì)胞數(shù)量減少或比例改變)，揭示了Th17/Treg 失衡在APS 免疫病理發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。CD4+CD25+Treg/Th17 細(xì)胞平衡將作為APS 病理機(jī)制及可能的治療新靶點(diǎn)而備受關(guān)注。本研究將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過口服低劑量抗原建立免疫耐受模型，通過干預(yù)及阻斷進(jìn)一步證實(shí)rhβ2GP1耐受反應(yīng)的主動抑制可能是由TGF-β 介導(dǎo)的［22，23］，同時(shí)來驗(yàn)證CD4+CD25+Treg/Th17 在EAPS 的發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

［1］胥 亞，許國瑩，周 紅，等.β2糖蛋白Ⅰ單克隆抗體的制備與鑒定［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29(6):649-652.

［2］Charavi AE，Wilson WA.The syndrome of thrombosis，thrombocytopenia，and recurrent spontaneous abortions associated with antiphospholipid antibodies:Hughes syndrome［J］.Lupus，1996，5:343-344.

［3］Levine JS，Branch DW，Rauch J.The antiphospholipid syndrome［J］.N Engl J Med，2002，346:752-763.

［4］Bill Giannakopoulos，F(xiàn)reda Passam，Soheila Rahgozar，et al.Current concepts on the pathogenesis of the antiphospholipid syndrome［J］.Blood，2007，109(2):422-430.

［5］Wei-Shiang Lin.Some antiphospholipid antibodies recognize conformational epitopes shared byβ2GPI and the homologous catalytic domanis of several serine proteases［J］.Arthritis Rheum，2007，6(5):1638-1647.

［6］Chen Z，O'Shea JJ.Th17 cells:a new fate for differentiating helper T cells［J］.Immunol Res，2008，1:87-102.

［7］Zhou L，Lopes JE，Chong MW，et al.TGF-beta-induced Foxp3 inhibits Th17 cell difierentiation by antagonizing ROR gammat function［J］.Nature，2008，453(7192):236-240.

［8］付 嘉，方艷秋，徐 立，等.人β2糖蛋白1 的重組表達(dá)及對抗磷脂抗體綜合征患者血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1 的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，32 (4):654-657.

［9］付 嘉，方艷秋，司傳平，等.實(shí)驗(yàn)性抗磷脂綜合征小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞及foxp3 表達(dá)的變化［J］.中國婦幼保健，2010，25(6):821-824.

［10］Miyakis S，Lockshin MD，Atsumi T，et al.International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS)［J］.J Thromb Haemost，2006，4(2):295-306.

［11］Nojima J，Kuratsune H，Suehisa E，et al.Association between the prevalence of antibodies to beta 2-glycoprotein 1.prothrombin，protein C，protein S，and annexin V in patient with systemic lupus erythematosus and thrombotic and thrombouytopenic complication［J］.Clin Chem，2001，47 (6):1008-1015.

［12］嚴(yán)一紅，周 紅，周保成，等.TLR4 在anti-β2GPI/β2GPI 復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞表達(dá)TF 中的作用探討［J］.中國免疫學(xué)雜志，2010，26(5):396-401.

［13］Tolomeo T，Rico De Souza A，Roter E，et al.T cells demonstrate aTh1-based response to native beta 2-glycoprotein I in amurinemodel of anti-phospholipid antibody induction［J］.Autoimmunity，2009，42(4):292-295.

［14］Sakaguchi S，SakaguchiN，AsanoM，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25)［J］.Immunol J，1995，155 (3):1151-1164.

［15］George D，Erkan D.Antiphospholipid syndrome［J］.Prog Cardiovasc Dis，2009，52 (2):115-125.

［16］Pierangeli SS，Chen PP，Raschi E，et al.Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome:pathogenic mechanisms［J］.Semin Thromb Hemost，2008，34 (3):236-250.

［17］André S，Tough DF，Lacroix-Desmazes S，et al.Surveillance of antigen-presenting cells by CD4+CD25+regulatory T cells in autoimmunity:immunopathogenesis and therapeutic implications［J］.Am J Pathol，2009，174 (5):1575-1587.

［18］孟 荔，歐陽建.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與自身免疫?。跩］.中國組織 程研究與臨床康復(fù)，2007，11 (33):6676-6680.

［19］Waid DM，Vaitaitis GM，Pennock ND，et al.Disruption of the homeostatic balance between autoaggressive (CD4+CD40+)and regulatory (CD4+CD25+FoxP3+)T cells promotes diabetes［J］.J Leukoc Bio，2008，84 (2):431-439.

［20］Wan S，Xia C，MorelL.IL-6 produced by dendritic cells from lupus-pronemice inhibits CD4+CD25+T cell regulatory functions［J］.J Immuno，2007，178 (1):271-279.

［21］Valencia X，StephensG，GoldbachManskyR，et al.TNF downmodulates the function of human CD4+CD25+T regulatory cells［J］.Blood，2006，108 (1):253-261.

［22］付 嘉，譚 巖，方艷秋，等.重組人β2糖蛋白1 作為抗磷脂抗體綜合征口服耐受原的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國免疫學(xué)雜志，2009，25(8):752-764.

［23］付 嘉，方艷秋，司傳平，等.口服重組β2糖蛋白1 的實(shí)驗(yàn)性抗磷脂綜合征小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及Foxp3 mRNA 表達(dá)變化［J］.中國免疫學(xué)雜志，2011，27(12):1073-1077.