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    β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠Treg/Th17 細(xì)胞比率變化的研究①

    2015-03-18 11:41:16王峻松戴鶴玲方艷秋
    中國免疫學(xué)雜志 2015年4期
    關(guān)鍵詞:糖蛋白磷脂免疫性

    徐 立 王峻松 閆 巖 劉 磊 戴鶴玲 付 嘉 方艷秋 譚 巖

    (吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,長春 130041)

    抗磷脂抗體綜合征(Antiphospholipid syndr- ome,APS)為一組自身免疫系統(tǒng)疾病,其臨床癥狀主要表現(xiàn)為血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)和血小板減少癥等。APS 除原發(fā)性外,也有繼發(fā)性疾病。血栓形成是APS 突出的臨床表現(xiàn)和主要的病理變化[1]。Charavi 等[2]的研究認(rèn)為,APS 患者血栓形成的基礎(chǔ)為血清中存在高濃度抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody,aPL)。aPL 是針對帶負(fù)電荷磷脂的一組自身抗體,主要包括磷脂結(jié)合蛋白如β2-糖蛋白1(β2-glycoprotein l,β2-GP1)、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、annexinV 等而產(chǎn)生病理生理反應(yīng)[3]。研究認(rèn)為β2-GP1 是aPL 的主要靶抗原之一[4,5],其是肝細(xì)胞合成的并存在于血漿中的一種糖蛋白,由于其本身存在磷脂結(jié)合位點(diǎn),又稱為載脂蛋白H(ApoH),是抗磷脂抗體和磷脂結(jié)合的輔助因子。自身免疫系統(tǒng)疾病免疫細(xì)胞參與其發(fā)病機(jī)制是必不可少的,初始CD4+T 細(xì)胞可分化為Th1、Th2 和Th17、Treg 4 個(gè) 主 要 的 細(xì) 胞 亞 群,Th17、Treg 亞群不同于經(jīng)典的Th1、Th2 亞群,其與自身免疫性疾病和感染免疫有密切關(guān)系,通過產(chǎn)生特征性的細(xì)胞因子發(fā)揮其功能[6]。TGF-β 單獨(dú)可誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞分化為Treg 細(xì)胞,分泌TGF-β 并表達(dá)標(biāo)志性分子Foxp3,主要維護(hù)機(jī)體免疫平衡;低濃度的TGF-β 和IL-6 的聯(lián)合可誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞,主要分泌lL-17細(xì)胞因子發(fā)揮其功能。因此,TGF-β 這種雙重效應(yīng)在T 細(xì)胞分化過程中具有重要的作用[7]。Treg細(xì)胞和Th17 細(xì)胞已成為當(dāng)今免疫學(xué)方面研究的熱點(diǎn)之一,Th17/Treg 平衡越來越多地得到專家們的認(rèn)可和關(guān)注,資料顯示CD4+CD25+Treg/Th17細(xì)胞失衡在許多免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而CD4+CD25+Treg/Th17 細(xì)胞失衡是否參與調(diào)控抗磷脂綜合征的發(fā)病機(jī)制國內(nèi)外鮮見報(bào)道。

    為了探索CD4+CD25+Treg/Th17 數(shù)量與比值的變化是否調(diào)控APS 的發(fā)病,本研究組以原核表達(dá)人β2糖蛋白1(rhβ2GP1)免疫BALB/c 小鼠建立APS 動物模型,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg/Th17 細(xì)胞頻率及比值變化,揭示APS 發(fā)病的細(xì)胞免疫病理基礎(chǔ),為疾病治療尋找靶點(diǎn)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 PE-anti-CD4 單抗、FITC-anti-CD25單抗及同型對照γ1/γ2(BD 公司),PE-anti-IL-17 單抗(eBioscience),小鼠抗人β2GP1 抗體(鼎國生物公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術(shù)公司),CFA(Sigma),心磷脂標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma),β2GP1 標(biāo)準(zhǔn)品(Advtech),IL-6、IL-2、IL-17、TGF-β 定量ELISA 試劑盒(R&D 公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c 小鼠,雌性,8~10 周,購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心,無特定病原菌(Specific pathogen free,SPF)條件下飼養(yǎng)。

    1.3 方法

    1.3.1 人β2糖蛋白1 的重組表達(dá)詳見文獻(xiàn)[8]。

    1.3.2 實(shí)驗(yàn)性APS 模型的建立詳見文獻(xiàn)[9]。

    1.3.3 外周血CD4+CD25+Treg、Th17 細(xì)胞的檢測分別在免疫后4、8、12、16、20 周無菌取小鼠尾靜脈血,肝素抗凝。取100 μl 全血,分別加入抗CD4、抗CD25、抗IL-17 抗體各10 μl,另設(shè)對照管,加入同型陰性對照γ1/γ2,室溫孵育20~30 min,加入紅細(xì)胞裂解液,振蕩混勻,室溫孵育10 min,1000 r/min 洗滌5 min,棄上清,將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS 洗滌液中,振蕩混勻后上機(jī)檢測淋巴細(xì)胞亞群及CD4+CD25+Treg、Th17 細(xì)胞亞群水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA 分析,組間比較采用方差分析,P <0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠APS 標(biāo)志變化 與對照組相比,模型組小鼠的anti-β2GP1 和aCA 滴度升高,流產(chǎn)率升高,PLT 降低,APTT 延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。結(jié)果見圖1。

    圖1 模型組APS 標(biāo)志物的變化Fig.1 Values of markers in EAPS

    圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測4 至20 周Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞變化Fig.2 Detection of Treg and Th17 cells from 4 w to 20 w by flow cytometry

    圖3 各組CD4 +CD25 +Treg/Th17 細(xì)胞頻率變化比較Fig.3 Compared with control group,alteration of percentages and ratio of CD4 +CD25 +Treg/Th17

    2.2 小鼠PBMC 中CD4+CD25+Treg、Th17 細(xì)胞的變化 分別在免疫后4、8、12、16 和20 周流式檢測模型及對照組小鼠的CD4+CD25+Treg 和Th17 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的頻率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,CD4+CD25+Treg 細(xì)胞頻率在4、8 周未見明顯變化(P >0.05),但12 周后開始逐漸下降(P <0.05);而Th17細(xì)胞頻率隨時(shí)間增加逐漸升高,與同時(shí)間段對照相比差異顯著(P <0.05);CD4+CD25+Treg/Th17 比值隨時(shí)間逐漸下降,與正常對照組相比差異顯著(P <0.05)。對照組在不同時(shí)間點(diǎn)的兩種細(xì)胞的頻率均無差異(P >0.05)。結(jié)果見圖2、3。

    圖4 與對照組比較,EAPS 組細(xì)胞因子水平的變化Fig.4 Compared with control group,values of cytokines in EAPS

    2.3 β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠免疫因子水平變化 與對照組相比,β2GP1 誘導(dǎo)的EAPS 小鼠靜脈血中IL-17、IL-2 及IL-6 水平明顯升高,而TGF-β 水平下降(P <0.05)。結(jié)果見圖4。

    3 討論

    抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome,APS)為一類系統(tǒng)性自身免疫疾病,其特征主要為血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)及一組自身抗體持續(xù)陽性[10]。研究表明,血清中存在高滴度的抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody,aPL)是患者形成血栓的關(guān)鍵[11],而其中β2糖蛋白1(beta-2-glycoprotein 1,β2GP1)又是aPL 的關(guān)鍵靶抗原,是磷脂與其抗體(anti-β2GP1)結(jié)合的輔助因子,在APS 血栓形成的病理過程中發(fā)揮著重要作用,其主要在肝臟合成[12]。

    自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病的關(guān)鍵是正常的免疫平衡被打破,繼而產(chǎn)生了一系列針對自身正??乖目贵w,從而引發(fā)了強(qiáng)烈免疫應(yīng)答[13]。CD4+CD25+Treg 是由Sakaguchi 等[14]在1995 年首先提出來的,其缺失可引起小鼠自身免疫性疾病,而過繼免疫則可預(yù)防其發(fā)生,其主要表達(dá)CD4、CD25 和標(biāo)志性分子Foxp3,后者對此類細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持具有重要作用。CD4+CD25+Treg 具有免疫抑制和免疫無能兩大特性,對維持機(jī)體自身免疫耐受具有重要作用,其數(shù)量或功能改變均可導(dǎo)致免疫失衡,尤其減少可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[15-18]。Th17 主要分泌IL-17A 而被命名。其還可以分泌IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)等細(xì)胞因子。在自身免疫性疾病及炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的作用,視黃酸相關(guān)孤兒核受體(RORyt)為Th17 主要的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控Th17 分化。Treg 和Th17 細(xì)胞的平衡對免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用,自身免疫性疾病與感染性疾病往往表現(xiàn)為兩者的失衡。Treg 和Th17 細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)主要通過不同的細(xì)胞因子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的。IL-17 為促炎因子引起炎癥和自身免疫反應(yīng)。CD4+CD25+Treg 調(diào)節(jié)T細(xì)胞則具有有較強(qiáng)的免疫抑制作用。促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg 細(xì)胞失衡可能是自身免疫性疾病發(fā)病的一個(gè)關(guān)鍵因素,因此,調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞比例,糾正兩者的失衡可能成為自身免疫性疾病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

    在本研究中,首先應(yīng)用重組hβ2GP1 免疫小鼠,成功誘導(dǎo)出了自身抗體anti-β2GP1 和aCA,并出現(xiàn)了APS 相關(guān)的促凝血表現(xiàn):APTT 延長及血小板升高等。EAPS 模型組細(xì)胞IL-17、IL-6 及IL-2 滴度顯著升高,而TGF-β 滴度顯著降低。免疫4~8 周,模型組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比率基本無改變,而后逐漸降低,均低于對照組。因前4 周為自身反應(yīng)性T/B 淋巴細(xì)胞增殖活化時(shí)期,CD4+CD25+Treg 與效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞暫時(shí)維持動態(tài)平衡,此時(shí)機(jī)體對自身組織仍處于耐受狀態(tài)[19]。同時(shí),源于自身免疫應(yīng)答產(chǎn)生的大量致炎因子如IL-17[20]、IL-6[21]、TGF-β等均可不同程度抑制CD4+CD25+Treg 的功能,因此該代償性平衡是有限度的,一旦平衡被打破,CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比率則開始下降,但Th17 細(xì)胞在IL-6 和低濃度TGF-β 同時(shí)作用的情況下表達(dá)逐漸升高,均高于對照組。當(dāng)CD4+CD25+Treg 的抑制功能不足以維持免疫平衡,以致其他效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞不斷增殖,CD4+CD25+Treg/Th17 比值明顯低于對照組,就會導(dǎo)致APS 的發(fā)生。該研究結(jié)果揭示,CD4+CD25+Treg/Th17 在EAPS 免疫病理發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示EAPS 小鼠血漿中Th17/Treg 失衡(細(xì)胞數(shù)量減少或比例改變),揭示了Th17/Treg 失衡在APS 免疫病理發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。CD4+CD25+Treg/Th17 細(xì)胞平衡將作為APS 病理機(jī)制及可能的治療新靶點(diǎn)而備受關(guān)注。本研究將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過口服低劑量抗原建立免疫耐受模型,通過干預(yù)及阻斷進(jìn)一步證實(shí)rhβ2GP1耐受反應(yīng)的主動抑制可能是由TGF-β 介導(dǎo)的[22,23],同時(shí)來驗(yàn)證CD4+CD25+Treg/Th17 在EAPS 的發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

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