重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠對深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合的影響及其機理分析

劉繼松，趙經(jīng)緯，章祥洲，杜 娟，方 勇

重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠對深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合的影響及其機理分析

劉繼松1，趙經(jīng)緯1，章祥洲1，杜 娟1，方 勇2

目的 驗證重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)對深I(lǐng)I度燒傷溶痂和愈合的效果并分析其可能的機理。方法 70只SD大鼠制成背部深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面后隨機分為實驗組和對照組，分別于制創(chuàng)后1、3、5、7、10、14和21d觀察2組動物創(chuàng)面情況并攝像，記錄創(chuàng)面愈合時間；用圖像分析軟件計算不同時相點的溶痂率；ELISA法測定創(chuàng)面彈力蛋白酶(NE)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-9)的蛋白表達。結(jié)果 實驗組創(chuàng)面溶痂時間為(10.73±2.47)d，較對照組(14.26±2.65)d顯著縮短(P<0.01)；實驗組和對照組創(chuàng)面愈合時間分別為(16.21±1.27)d和(18.05±1.36)d，差異有非常顯著性(P<0.01)；2組動物創(chuàng)面?zhèn)?～7 d,NE、MMP-1和MMP-9水平實驗組明顯高于對照組(P<0.01)。結(jié)論 外源性rhGM-CSF的應(yīng)用可提高創(chuàng)面局部NE、MMP-1、MMP-9的蛋白表達，促進創(chuàng)面溶痂，從而促進深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合。

燒傷； 深I(lǐng)I度； 創(chuàng)面愈合； 溶痂； 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子

深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面壞死組織是影響創(chuàng)面愈合的重要因素，由于其壞死組織的持續(xù)存在，導(dǎo)致局部組織進行性損害和創(chuàng)面感染的發(fā)生[1]，及早清除壞死組織是加快創(chuàng)面愈合的重要手段。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ，GM-CSF)是來源于創(chuàng)面修復(fù)細胞的四螺旋束原型結(jié)構(gòu)的細胞因子，近年來的研究表明，GM-CSF是一種多功能生長因子與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)，動物實驗研究證實[2-3]，GM-CSF通過激活創(chuàng)面局部炎癥細胞促進創(chuàng)面愈合。由于炎癥細胞激活和其所分泌的蛋白酶的作用是深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面溶痂的重要因素，故我們設(shè)想GM-CSF可能具有通過激活創(chuàng)面局部炎癥細胞，促進創(chuàng)面蛋白酶類分泌，發(fā)揮深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面溶痂的作用，并以此促進創(chuàng)面愈合。本研究將通過動物實驗來驗證重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)是否促進創(chuàng)面釋放的酶物質(zhì)(如彈力蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶)等促進創(chuàng)面壞死組織脫落而起到加速創(chuàng)面愈合作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物及試劑：實驗動物：雄性SD大鼠70只，8～10周齡，體重230～260 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證號碼為SCXK(滬)2007-2005，使用許可證號碼為2003-0026。動物自由飲食，飼養(yǎng)于標準動物房內(nèi)。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進行試驗。試劑使用：外用重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子凝膠(rhGM-CSF100μg/10g)，凝膠基質(zhì)(不含rhGM-CSF)由長春金賽藥業(yè)有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 燒傷動物模型制作 燒傷創(chuàng)面模型制作及干預(yù)措施：實驗大鼠用3%戊巴比妥鈉(50 mg/Kg)腹腔注射麻醉。麻醉起效后，背部用理發(fā)器剃毛，硫化鋇脫毛后用電熱恒溫水浴箱在大鼠背部，制成3 cm×3 cm的圓形深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面(致傷溫度為75℃，致傷時間8 s)。次日經(jīng)病理證實為深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面。

1.2.2 分組處理 創(chuàng)面模型制作完成后，70 SD燒傷大鼠根據(jù)創(chuàng)面不同的處理方式分為2組：rhGM-CSF處理組(n=35)：創(chuàng)面給予外用100 μg/10g rhGM-CSF凝膠；對照組(n=35)：創(chuàng)面給予外用不含任何藥物的凝膠。所有創(chuàng)面均清潔包扎防污染，分籠飼養(yǎng)，每日換藥至傷后21 d或創(chuàng)面完全愈合為止。

1.3 觀察和檢測項目 分別于創(chuàng)面形成的第1、3、5、7、10、14、21天各組隨機取動物5只，用透明方格紙測得創(chuàng)面痂皮面積后處死，切取創(chuàng)面組織用于基質(zhì)金屬蛋白酶的測定。

1.3.1 創(chuàng)面溶痂率的測定 采用透明方格紙，沿創(chuàng)面痂皮邊緣描記創(chuàng)面大小形狀，以用藥前痂皮面積為初始面積，分別記錄各組創(chuàng)面形成后第1、3、5、7、10、14天痂皮面積。Osiris 軟件進行創(chuàng)面痂皮面積計算。公式如下：創(chuàng)面溶痂率=(創(chuàng)面初始痂皮面積-創(chuàng)面形成后第n天的創(chuàng)面痂皮面積)/創(chuàng)面初始痂皮面積×100%。

1.3.2 創(chuàng)面愈合時間 記錄2組大鼠燒傷創(chuàng)面的愈合時間，并做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.3 創(chuàng)面活性酶的檢測 取待測的皮膚組織制備組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISA)定量測定皮膚組織中金屬蛋白酶(NE、MMP-1、MMP-9)的含量。檢測嚴格按照R&D試劑盒操作說明進行。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠創(chuàng)面溶痂率比較 實驗組大鼠在創(chuàng)面形成后第5、7、10天溶痂率均明顯高于對照組(P<0.01)；而2組大鼠創(chuàng)面形成后第14天創(chuàng)面溶痂率無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 2組燒傷大鼠不同時間創(chuàng)面溶痂率(%)比較 ±s)

2.2 創(chuàng)面愈合時間 實驗組和對照組創(chuàng)面愈合時間分別為(16.21±1.27)d和(18.05±1.36)d，差異有非常顯著性(P<0.01)。

2.3 創(chuàng)面組織NE、MMP-1、MMP-9含量測定

2.3.1 中性粒細胞彈性蛋白酶 2組大鼠燒傷創(chuàng)面各時相點NE含量比較，大鼠皮膚組織中NE含量大體呈現(xiàn)第5天增高至峰值后漸降趨勢。傷前2組創(chuàng)面NE相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。燒傷后各時相點實驗組大鼠皮膚組織中NE含量均高于對照組，并于第3、5、7天最為顯著(P<0.01)。見表2。

表2 2組大鼠燒傷創(chuàng)面各時相點NE含量比較

2.3．2 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1的測定 2組大鼠燒傷創(chuàng)面各時相點MMP-1含量比較：大鼠皮膚組織中MMP-1含量大體呈現(xiàn)第3天增高至峰值后漸降趨勢。傷前，2組創(chuàng)面MMP-1相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。燒傷后各時相點實驗組大鼠皮膚組織中MMP-1含量均高于對照組，并于第3、5天明顯高于對照組(P<0.01)，MMP-1含量于燒傷后第3天差異最為顯著，實驗組創(chuàng)面MMP-1含量為(1165.51±104.58)μg/L，對照組為(796.52±76.27)μg/L。見表3。

表3 2組大鼠燒傷創(chuàng)面各時相點MMP-1含量比較

2.3．3 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的測定 2組大鼠燒傷創(chuàng)面各時相點MMP-9含量比較：大鼠皮膚組織中MMP-9含量大體呈現(xiàn)第3天增高至峰值后漸降趨勢。傷前兩組創(chuàng)面MMP-9相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。燒傷后各時相點實驗組大鼠皮膚組織中MMP-9含量均高于對照組，并于第3、5天顯著高于對照組(P<0.01)，MMP-9含量于燒傷后第3天差異最為顯著，實驗組創(chuàng)面MMP-9含量為(1258.51±123.18)μg/L，對照組為(839.42±69.12)μg/L。見表4。

表4 2組大鼠燒傷創(chuàng)面各時相點MMP-9含量比較

3 討論

深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面有其特殊的病理生理特點，其預(yù)后也不同于一般的機械性損傷。其根本原因在于燒傷創(chuàng)面本身的壞死組織。創(chuàng)面的壞死組織不僅會影響創(chuàng)面邊緣或殘留附件中的表皮細胞分裂增殖后向無表皮區(qū)爬行修復(fù)創(chuàng)面而且會引起局部的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致創(chuàng)面感染，加重創(chuàng)面的損害，使創(chuàng)面愈合延遲；因此及早去除創(chuàng)面壞死組織是深度燒傷治療的關(guān)鍵。目前去除深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面壞死組織的方法有手術(shù)削痂和藥物溶痂[4-6]，前者需掌握比較好的手術(shù)技巧，否則容易損傷正常組織，易使創(chuàng)面加深；后者則因為效果不佳，并易致創(chuàng)面感染，不宜被臨床接受[7-8]。因此有必要尋找一種方法，既能促使深度燒傷創(chuàng)面溶痂，又能啟動皮膚干細胞再生，達到加快創(chuàng)面修復(fù)的目的。目前研究認為[9]，對創(chuàng)面溶痂起促進作用的因素包括：(1)早期創(chuàng)面中性粒細胞、巨噬細胞的數(shù)量和功能；(2)各種活性酶類在創(chuàng)面中的釋放等。創(chuàng)面中的中性粒細胞巨噬細胞浸潤活化有利于其增加吞噬及分泌蛋白酶的功能，利于自身清除創(chuàng)面壞死組織，NE是中性粒細胞(poly-morphonuclear neutrophilic，PMNs)分泌的重要蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶的糜蛋白酶超家族成員，它能夠分解幾乎所有細胞外基質(zhì)和許多重要的血漿蛋白，被認為是最具破壞力的酶類之一。NE同時具有防御組織損傷、促分泌、放大炎癥等作用，NE的增高提示了中性粒細胞的活性和促進對壞死組織的溶解。加速局部壞死組織的脫落及對入侵細菌的防御力，促進機體的自溶性清創(chuàng)，提高局部免疫力以抗感染[10]，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)為一特異的酶家族，其成員均為鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶，主要功能為降解細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)。經(jīng)MMPs達到ECM 的可控性降解。

既往研究表明[11-12]，粒細胞單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)與創(chuàng)面愈合關(guān)系密切，GM-CSF基因缺失小鼠的創(chuàng)面愈合顯著延遲，而局部使用GM-CSF可以促進糖尿病小鼠切割傷創(chuàng)面愈合。GM-CSF促進創(chuàng)面愈合的機理可能是通過激活創(chuàng)面局部的炎癥細胞，通過細胞因子促進創(chuàng)面的血管化從而達到促進創(chuàng)面愈合的作用。研究表明GM-CSF是一種多動能生長因子，是否GM-CSF通多促進創(chuàng)面炎癥細胞浸潤及及其通過炎癥細胞所釋放的酶物質(zhì)(如彈力蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶)等促進創(chuàng)面壞死組織脫落而起到加速創(chuàng)面愈合作用，故我們通過動物實驗驗證GM-CSF是否具有促進深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面溶痂的作用而促進創(chuàng)面愈合。

本研究發(fā)現(xiàn)，深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面使用GM-CSF后，無論固定時相點創(chuàng)面溶痂率還是創(chuàng)面溶痂時間及創(chuàng)面愈合時間都較對照組顯著改善，固定時相點溶痂率顯著高于對照組，且創(chuàng)面愈合時間提前。實驗結(jié)果提示GM-CSF具有促進中性粒細胞彈性蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶的表達作用，以促進燒傷創(chuàng)面壞死組織的分解和脫落,從而促進創(chuàng)面愈合。

[1] 賈赤宇,陳 壁．復(fù)合皮研究的回顧與展望[J]．中華燒傷雜志，2002，18(1)：8．

[2] 方 勇,程瑞杰,王 瑩，等.糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合過程中炎癥細胞和GM-CSF表達[J].上海交通大學(xué)學(xué)報，2007，27(2):174-177.

[3] Fang Y,Gong SJ,Xu YH,et al.Impaired cutaneous wound healing in granulocyte/macrophage colony-stimulating factor knockout mice[J].Br J Dermatol，2007，157(3):458-465.

[4] LU S,Xiang J,Qing C,et a1．Effect of necrotic tissue on progressive injury in deep partial thickness burn wounds[J]．Chinese Medical Journal，2002，115(3)：323-325．

[5] Darryl T，Gray MPH，Richard W，et al．Early surgical excision versus convention therapy in patients with 20 to 40 percent burns，A Comparatives study[J]．The American Journal of Surgery，1982，144(1)：76．

[6] Hu W,Wang AM,Wu SY,et al．Debriding effect of bromelain on firearm wounds in pigs[J].Trauma，2011，71(4)：966-972．

[7] Singer AJ,McClain SA,Taira BR,et al.Rapid and selective enzymatic debridement of porcine comb burns with bromelain-derived debrase:acute-phase preservation of non injured tissue and zone of stasis[J].J Burn Care Res,2010,31(2):304-309.

[8] Ramundo J,Gray M.Enzymatic wound debridement[J].J Wound Ostomy Continence Nurs，2008,35(3):273-280.

[9] Mann A,Breuhahn K,Schirmacher P,et al.Keratinocyte-derived granulocyte-macrophage colony stimulating factor accelerates wound healing:Stimulation of keratinocyte proliferation,granulation tissue formation,and vascularization[J].J Invest Dermatol，2001，117(6):1382-1390.

[10]Dollery CM， Owen CA，Sukhova GK，et al.Neutrophil elastase in human atherosclerotic plaques：production by macrophages[J]．Circulation，2003，107(22)：2829-2836．

[11]方 勇,龔圣濟,王 瑩,等．單核細胞集落刺激因子缺失對小鼠創(chuàng)面愈合與新生血管化的影響[J]．中華整形外科雜志，2007, 23(3)：233-235．

[12]程瑞杰,方 勇,俞為榮,等.粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的作用[J].上海交通大學(xué)學(xué)報,2007,27(4)：415-418.

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Effects of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on debridement of deep partial-thickness burn

LIUJi-song,ZHAOJing-wei,ZHANGXiang-zhou,etal.

(BengbuThirdPeople'sHospital，Anhui233000，China)

Objective To determine the effect of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF) on debridement of eschar in deep partial thickness scalding wound and the mechanism for debridement of rhGM-CSF.Methods A total of 70 SD rats were scalded on the back.A deep partial-thickness burn was created in all the rats.The scalded rats were randomly divided into a control group(C) and an experimental group (E).Observations of the wounds were conducted by photograph at various time-points.In addition,the removal time of wound eschar in all animals was recorded.The percentages of removal area in the wounds were calculated by image analysis software in various time-points.ELISA was used to detect the expression of NE,MMP-1,and MMP-9.Results The average removal-time of eschar in the experimental group was 10.73 ± 2.47d，which was much shorter than that in the control group's 14.26 ± 2.65d(P<0.01).The time of wound healing in the experimental group was 16.21 ± 1.27d，which was significantly shorter than that in the control group's 18.05 ± 1.36d(P<0.01).The levels of NE,MMP-1 and MMP-9 in the experimental group were significantly higher than that in the control group from day 3 to 7 after injury(P<0.01).Conclusion RhGM-CSF gel may promote debridement and wound healing in deep partial thickness burn,the mechanism of which may be associated with upregulation of expression of the enzyme activity.

Burn; Deep partial-thickness burn; Wound healing; Debridement; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

10.14126/j.cnki.1008-7044.2015.03.004

1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院 燒傷整形科，233000；2.上海交通大學(xué)第三附屬人民醫(yī)院 燒傷整形科，上海 201999

劉繼松(1980-)，男，安徽蚌埠市人，主治醫(yī)師，研究生。

R644

A

1008-7044(2015)03-0219-03

2014-10-03)